identifier: Thompson, C. M. (2013). Development of a Production Process for a Virus Like Particle Based Vaccine in Cell Culture  [Mémoire de maîtrise, École Polytechnique de Montréal].

abstract: RÉSUMÉ: Chaque année, le virus de l'influenza est responsable d'un grand nombre de maladies et décès. Aux vues de la fréquence élevée de mutation du virus, l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) est en alerte permanente afin de répondre rapidement à toute émergence d'une souche pandémique. Bien que des thérapies anti-virales existent, la méthode la plus efficace contre toute propagation de la maladie est la vaccination. La majorité des vaccins disponibles sur le marché sont produits dans des oeufs et sont composés d'antigènes viraux purifiés séparés des virus entiers inactifs. Le système de production n'est cependant pas adapté à une situation de pandémie, la capacité étant limitée à une dose de vaccin par oeuf. Aussi, l'intervalle de 6 mois entre l'identification de la souche virale et la production du vaccin est trop longue pour envisager répondre de manière adéquate à la case l'émergence d'une pandémie. Pour ces raisons, les procédés de production de virus par culture cellulaire peuvent permettre de répondre de manière adéquate à une pandémie potentielle. Récemment, la Food and Drug Administration (FDA) a approuvé deux vaccins produits par culture cellulaire, le premier étant produit dans des cellules de mammifère tandis que le second est produit de manière recombinante dans des cellules d'insecte. Les vaccins à base de particules pseudo-virales (PPVs) représentent une des approches les plus prometteuses afin de répondre à la menace constante de l'apparition de souches pandémiques. Les PPVs sont des particules produites en culture cellulaire de manière recombinante et qui sont composées d'antigènes viraux capables d'induire une réponse immunitaire, bien que ces particules soient dénuées de matériel génétique viral. Alors que la plupart des travaux effectués sur les PPVs de l'influenza se sont concentrés sur les aspects immunologiques, peu d'études se sont attachées au procédé de production lui-même, et en particulier à son adaptation à une production industrielle. Une autre difficulté résulte du fait que les chercheurs ont jusqu'à présent utilisé des méthodes standards de quantification du virus de l'influenza afin de caractériser les vaccins potentiels, ces méthodes étant compatibles pour la quantification d'échantillons purifiés. Elles ne sont pas compatibles, cependant, avec l'analyse d'échantillons durant le procédé de production. C'est une des raisons pour lesquelles l'étude du procédé de production lui-même reste à accomplir. viii Les études précédentes sur les PPVs de l'influenza ont été principalement effectuées dans des cellules d'insecte en utilisant le système d'expression du baculovirus (BEVS). Ces études ont également démontré une contamination par le baculovirus recombinant. Cependant, il a été également démontré que le baculovirus comprenant des promoteurs de mammifères (Bacmam) est capable de transduire de manière efficace des cellules de mammifères et d'exprimer ultérieurement des gènes sous le contrôle de promoteurs de mammifères. Un tel baculovirus est ainsi incapable de se répliquer, ce qui réprime de manière efficace la production contaminante de baculovirus. Afin de remédier à une possible contamination par le baculovirus, la production de PPVs a été effectuée dans des cellules HEK 293 cultivées en suspension en utilisant le système Bacmam. Le système fut évalué pour sa capacité de production PPVs de l'influenza composées d'hémaglutinine (HA), de neuraminidase (NA) ainsi que de protéines matricielles (M1). Ces PPVs ont ensuite été comparées à des PPVs produites dans ces cellules Sf9. Les PPVs des deux systèmes ont été caractérisées avec les méthodes de quantification présentement disponibles : test SRID (single radial immunodiffusion assay), test d'hémagglutination, microscopie électronique en coloration négative et western blot. Les PPVs étaient présents dans le culot ainsi que dans le surnageant dans la production pour les cellules HEK 293. Dans les cellules Sf9, la production de PPVs était 1.5 log plus importante que dans les cellules HEK 293. Les PPVs produites dans les cellules Sf9 avaient une activité totale HA plus importante et étaient de manière générale plus homogènes en termes de morphologie et taille. Cependant, les PPVs produites dans les cellules Sf9 contiennent 20 fois plus de baculovirus que de PPVs, ce qui peut contribuer à l'activité détectée dans les tests HA et SRID. Cette conclusion doit être prise en compte au cours du développement du procédé de production. Cette étude démontre les avantages du système de baculovirus pour la production de PPVs dans les cellules d'insecte par rapport à de la production dans les cellules HEK 293. Cette étude démontre également qu'une purification du baculovirus contaminant est également nécessaire avant de pouvoir considérer ces PPVs comme des vaccins potentiels.  ABSTRACT: Each year, influenza is the cause for many cases of illness and deaths worldwide. Due to the virus' fast mutation rate, the World Health Organization (WHO) is constantly on alert to be able to respond rapidly in the case of the emergence of a pandemic strain. Although anti-viral therapies exist, the most proficient way to stop the spread of disease is through vaccination. The majority of influenza vaccines on the market are produced in embryonic hen's eggs and are composed of purified viral antigens split from inactivated whole virus. This manufacturing system, however, is limited in its production capacity, especially in the case of a pandemic, producing approximately one vaccine dose per egg. Additionally, the process from strain identification to vaccine release is about 6 months, which is relatively long especially if a vaccine is urgently needed. For this reason, cell culture processes for vaccine production are a topic of interest amongst the vaccine industry to better respond to the threat of a potential influenza pandemic. Recently, the FDA, supporting the basis for this research, has approved two cell culture based vaccines, the first produced in mammalian cells and the second in insect cells using recombinant technology. Virus-like particle (VLP) vaccines are one of the most promising approaches to respond to the constant threat of the emergence of pandemic strains. VLPs are particles produced in cell culture utilizing recombinant protein technology composed of viral antigens that can elicit immune response but lack viral genetic material. Most of the work done on influenza VLPs have focused on the immunological aspects of VLPs with little attention paid to bioprocessing, in particular the scalability of the production methods. Another challenge stems from the fact that researchers have used standard influenza virus quantification techniques up to this point to characterize VLP vaccine candidates, as they are suitable methods to use for purified samples. These methods, however, are not suitable for in-process analysis of samples, which is generally the case for process development. As a result, process development is quite challenging without an appropriate quantification method, which is one reason this avenue has not been fully explored. Past influenza VLP studies have been mainly performed in the baculovirus expression vector system (BEVS) in insect cells and report contamination with recombinant baculovirus. However, baculovirus with mammalian promoters (Bacmam) have been shown to efficiently transduce vi mammalian cells and further express genes under mammalian promoter control but are unable to replicate, efficiently repressing contaminating baculovirus production. In order to address the issue of baculovirus contamination, VLP production was performed in HEK 293 suspension cells using the Bacmam gene delivery system. The proposed system was assessed for its ability to produce influenza VLPs composed of Hemagglutinin (HA), Neuraminidase (NA) and Matrix Protein (M1) and compared to VLPs produced in Sf9 cells through the lens of bioprocessing. VLPs from both systems were characterized using currently available influenza quantification techniques such as single radial immunodiffusion assay (SRID), HA assay, negative staining electron microscopy (NSEM) and western blot. VLPs were found to be associated with the cell pellet in HEK 293 production in addition to in the supernatant. It was found that VLP production in Sf9 cells produced 1.5 logs more VLPs than in HEK 293. Sf9- VLPs had higher total HA activity and were generally more homogeneous in morphology and size. However, Sf9 VLP samples contained 20 times more baculovirus than VLPs. Baculovirus can contribute to HA activity in both the HA assay and SRID, which should be acknowledged during process development stages. This study shows the strength of the insect-cell baculovirus system for VLP production when compared to proposed alternatives in HEK 293 cells from the bioprocessing point of view but also highlights that there is a major need for baculovirus removal to properly characterize and consider them as vaccine candidates.


identifier: Guérineau, H. (2013). Sources et risques de contamination dans une source d'eau potable  [Mémoire de maîtrise, École Polytechnique de Montréal].

type:
Mémoire ou thèse
NonPeerReviewed

abstract: RÉSUMÉ: La protection des sources d'eau potable constitue un nouvel enjeu réglementaire. Une future règlementation, mise en place par le Ministère du Développement Durable, de l'Environnement, de la Faune et des Parcs (MDDEFP), obligera les exploitants de captages à identifier les dangers présents dans les sources d'eau potable. Certains risques sont spécifiques aux sources d'eau potable situées en milieu urbain (fuite d'eaux usées, ruissellements sur des zones urbanisées ou industrielles, remises en suspension de sédiments contaminés, déversement accidentel de produits toxiques, etc.). L'objectif principal de ce projet est d'identifier les risques de contamination pouvant affecter une source d'eau potable en milieu urbain, en se basant sur l'étude de cas anonymisée d'un canal urbain dont le rôle est d'approvisionner une usine de traitement de l'eau potable. Diverses études préliminaires ont identifié une augmentation des concentrations en indicateurs fécaux dans le canal urbain étudié au cours d'une période estivale, ainsi que la légère contamination des sédiments en métaux. En complément de l'identification des zones de contamination et des sources probables de ces contaminants le long du canal, ce mémoire vise à évaluer les risques potentiels à la prise d'eau potable de l'usine afin de proposer des mesures préventives et correctrices.  ABSTRACT: The protection of drinking water sources is a new regulatory issue. Future regulations, established by the Ministry of Sustainable Development, Environment, Fauna and Parks (MDDEFP), require operators to identify catchment hazards in drinking water sources. Some risks are specific to drinking water sources in urban areas (leaky sewers, runoff on urban or industrial areas, resuspension of contaminated sediment spill of toxic products, etc.). The main objective of this project is to identify the potential contaminants that can affect a source of drinking water in urban areas, based on the case study of an urban channel whose role is to supply a drinking water treatment plant. Several preliminary studies have identified increasing concentrations of fecal indicators in the studied urban canal during summer, and a slight contamination of the sediments by metals. In addition to identifying areas of contamination and the likely sources of these contaminants along the canal this thesis aims to assess the potential risks to a drinking water plant's intake to provide preventive and corrective measures.


identifier: Contreras Romero, C. A. (2013). Comportement dynamique du sol pulvérulent "résidus miniers"  [Mémoire de maîtrise, École Polytechnique de Montréal].

abstract: RÉSUMÉ: La réponse dynamique des résidus miniers provenant des roches dures a été étudiée en utilisant des essais triaxiaux cycliques soumis à une gamme de contraintes de confinement isotropes et anisotropes (Ko=0.4) variant de 100kPa à 400kPa, à des rapports de contrainte cyclique variant de 0,075 à 0,17 et à des fréquences de chargement de 0.2, 1.0 et 2.0 Hz. La méthode de préparation de l'échantillon développé par Poncelet (2012) a été utilisée pour simuler la déposition hydraulique et afin d'assurer la saturation des échantillons sans utiliser la méthode de contrepression. L'analyse des résultats indique que la résistance cyclique augmente avec la contrainte de consolidation pour des conditions de consolidation isotrope. Cependant, la résistance cyclique des résidus diminue légèrement avec l'augmentation de la contrainte de consolidation pour des conditions de consolidation anisotrope. La résistance cyclique a été légèrement affectée par la consolidation anisotrope, mais elle n'a pas été affectée par la fréquence de chargement.  ABSTRACT: The dynamic response of tailings from hard rock was studied using cyclic triaxial testing using a range of isotropic and anisotropic (K0=0.4) confining stresses varying from 100 kPa to 400 kPa, CSR values varying from 0.075 to 0.17 and loading frequencies of 0.2, 1.0 and 2.0 Hz. The sample preparation method developed by Poncelet (2012) was used to simulate hydraulic deposition and to ensure saturation of specimens without the use back-pressure. Analysis of the results indicates that the cyclic resistance increased with increasing confining stress for isotropic consolidation. However, the cyclic resistance decreased slightly with increasing confining stress for anisotropic consolidation. The cyclic resistance was slightly affected by anisotropic consolidation but unaffected by the loading frequency.


identifier: Perret, T. P. (2013). Modélisation d'une application de décentralisation de serveurs web  [Mémoire de maîtrise, École Polytechnique de Montréal].

abstract: RÉSUMÉ: L'utilisation d'Internet dans notre vie est aujourd'hui devenue quotidienne et indispensable. Au delà de l'accès à des services en ligne gouvernementaux ou commerciaux, Internet a permis à ses utilisateurs de diffuser de l'information accessible par l'ensemble des autres utilisateurs. L'Internet est un réseau qui ne comprend structurellement aucun centre et qui n'introduit aucun hiérarchie parmi les machines connectées et disposant d'adresses IP. On assiste cependant à une asymétrie de plus en plus importante entre les différents opérateurs réseaux. Certains opérateurs Internet se spécialisent dans la fourniture d'accès Internet aux particuliers, alors que d'autres sont spécialisés dans l'hébergement de serveurs et possèdent la majorité du contenu désiré par les internautes. Cela entraîne donc un trafic inter-AS totalement déséquilibré, permettant difficilement à de nouveaux opérateurs de s'interconnecter, en plus de poser des problèmes de concentration de l'information auprès de seulement quelques très grosses entreprises, ce qui soulève des problèmes de vie privée et de contrôle de données numériques. De par les usages, des centres artificiels sont ainsi créés. Le protocole IP étant neutre, il ne différencie pas les paquets provenant de serveurs ou de clients et ne fait que les transporter dans le réseau jusqu'à leur destinataire. L'hébergement sur une connexion Internet à usage personnel est donc possible mais relativement limité puisque la bande passante de ces utilisateurs est relativement faible et ces serveurs supporteraient très mal la montée en charge. Notre projet vise donc à proposer une manière simple et efficace pour un internaute quelconque de partager du contenu en s'affranchissant d'un hébergement en salle machine sauvant par la même occasion les coûts de location associés. Le partage devra s'effectuer de manière transparente pour les clients du site web qui ne changeront nullement leur façon de s'y connecter, tout en offrant une bande passante suffisamment importante pour résister à la montée en charge. Pour ce faire, nous introduirons le concept de partageur, correspondant à un client du site qui, sachant que le site à une capacité d'être partageable, prendra la décision d'installer un logiciel sur son ordinateur. Il permettra ainsi d'absorber une partie de la charge totale du site lorsque son ordinateur sera allumé. Le logiciel en question utilisera la bande passante restante et non utilisée ainsi que l'espace disque que l'internaute a bien voulu lui concéder. Plus le nombre de partageurs est important, plus le site web partagé sera robuste autant en matière de disponibilité qu'en tentative de censure. Nous passerons en revue le fonctionnement de plusieurs protocoles sur lesquels nous nous appuierons par la suite et verrons également des projets se rapprochant de notre solution sans pour autant répondre à nos hypothèses de départ. Par la suite, nous détaillerons l'ensemble des serveurs et logiciels que nous utiliserons et la façon dont ils traiteront les requêtes des clients. L'objectif étant pour les clients de ne pas modifier leur comportement pour récupérer des pages web, nous expliquerons en détail le mécanisme que nous proposerons afin de répartir la charge du site web partagé, sans pour autant introduire de point central dans notre architecture. Nous utiliserons pour cela le protocole DNS, auquel nous couplerons le protocole Kademdlia fonctionnant sur le principe de tables de hachage distribuées. Pour cela, nous présenterons un mécanisme de conversion d'adresses IP en ASCII et inversement et utiliserons les différents types d'enregistrement DNS, comme les délégations de zones et les noms canoniques. Nous verrons ensuite comment nous permettons aux différents partageurs d'alléger le nombre de requêtes leur provenant en distribuant les ressources associées (images, scripts Javascript, feuilles de style\dots) qui seront demandées par les clients, une fois les pages HTML ou les feuilles CSS téléchargées. Pour récupérer initialement les ressources du site, le partageur devra les récupérer par pair-à-pair en utilisant le protocole Bittorent couplé avec Kademlia. Nous continuerons donc par expliquer comment le logiciel pair-à-pair sera calibré, quelles ressources il devra récupérer en priorité et comment il communique avec les autres programmes. Nous finirons notre prototypage par introduire des métriques et des seuils permettant la prise de décision pour les différents serveurs applicatifs. Pour tester notre modèle, nous le comparerons à un une approche client/serveur avec un serveur en salle machine. Le débit, le nombre et la durée de connexion des partageurs dépendent de facteurs externes difficilement modélisables. Nous ferons donc des approximations en utilisant des études statistiques et comparerons les deux modèles sur les débits offerts dans un premier temps avant de nous pencher sur le taux de disponibilité. Les résultats de nos simulations nous montrerons des données encourageantes puisqu'avec un nombre de partageurs raisonnable (inférieur à 100) et un nombre important de clients, nous serons capable d'égaler les performances d'un serveur en salle machine, sur les critères que nous aurons préalablement défini.  ABSTRACT: The use of the Internet in our today's society has become an essential part of our daily life. Not only do we use it by accessing online government web services or commercial websites but also in order to communicate with others. This could be by email, instant messaging or by sharing articles on websites if the targeted audience is aimed to be as big as possible. Everyone has now the ability to share information reachable by anyone on the planet. The Internet is a network with no centre or head that may regulate it. As its name states, it is an inter-network, a collection of thousands of different networks interconnected between each other and using the same protocol called the Internet Protocol (IP). However, we can notice a growing asymmetry between the traffic of the different network operators these days. Some ISP would only focus on targeting end user customers while in the same time, the others would only offer hosting rental plans and have the vast majority of the content that users want. The consequences are a totally unbalanced inter-AS traffic, giving the possibility for new comers to interconnect very difficult, as well as raising concerns about the concentration of all the information by only several companies on  privacy and data control issues. By the use of the today's Internet, artificial centres have been created. IP is a neutral protocol that doesn't treat differently packets coming from servers than the ones from clients. Its only job is to carry the packets trough the network to the recipient. Thus, server hosting on a domestic Internet access is possible but rather limited since the usual bandwidth is too low to support scalability. Our project aims to tackle this issue by giving a simple and efficient way for Internet users to share contents without having to host those on a data-centre and in the same time being rid of monthly fees too. Web share will have to be transparent for the end users that will not change their way of sending requests. It also has to offer enough bandwidth to resist scalability. In order to do this, we are going to introduce the notion of sharer. A sharer is a client of the website that took the decision to install a piece of software on his/her computer, knowing that the website offers shared capabilities. All sharers, by doing this, will let clients of the website request contents on their computer when it's turned on. The piece of software will use the remaining bandwidth and the amount of space on the HDD/SSD the user would have let it first. The more the number of sharers is important, the more the shared website will be robust enough in term of availability as well as censorship. We will first see all the detail mechanisms of several interesting protocols that we will use on our solution such as HTTP, DNS as well as the different types of peer-to-peer protocols. We will also look over the different existing projects similar to what we aim to do but without answering to our initial requirements. Then, in the part of the establishment of the model, we will see which software we will use and how we answer client requests. The goal is for the client not to modify their usual behaviour on how they usualy proceed to retrieve web pages. We will then go through a detail explanation on how we manage load balancing between the different sharers without introducing a central point (or SPOF) in our architecture. We will use to answer this question, the DNS protocol that we will peer with the Kademlia protocol using DHT tables. To do this, we will introduce a way to translate IP addresses in ASCII characters and vice versa and we will take advantage of the different records offered by DNS such as zone delegation or canonical names. Then we will see how we manage to lighten the number of resource requests by distributing the associated related resources (such as images, Javascript scripts or CSS sheets) that would be requested by clients when downloads of HTML pages or CSS sheets have been completed. To initially retrieve the resources of the website , the sharers would have to download those on a peer-to-peer network using the Bittorent protocol peered with Kademlia. We will pursue by explaining how we calibrate the peer-to-peer application that we will use, which resources should be downloaded in priority and how it communicates whith the other pieces of software we will be using. Finally, we will introduce metrics and thresholds letting the different servers to take a decision on how they should behave. To evaluate our model, we will compare it to a client/server based server stored in a data-centre. The throughput, the number of sharers and the duration of the connections are external factors difficult to emulate since they are based on human interaction, especially the duration evaluation. We will make approximations and add random factors in our statistic studies in order to make the comparison bewteen our two models on throughput first before going trough disponibily. Our results will show interesting data. With a rather limited number of sharers (under 100) we will be able to reach the same results and quality compared to a server in a data-centre on the critera we will have defined before.


identifier: Tapp, M. (2013). Automating System-Level Data-Interchange Software Through a System Interface Description Language  [Thèse de doctorat, École Polytechnique de Montréal].

abstract: RÉSUMÉ: Les plates-formes d'aujourd'hui, telles que les simulateurs de missions (FMS), présentent un niveau sans précédent d'intégration de systèmes matériels et logiciels. Dans ce contexte, les intégrateurs de systèmes sont confrontés à une hétérogénéité d'interfaces système qui doivent être alignées et reliées ensemble afin de fournir les capacités prévues d'une plate-forme. Le seul aspect des échanges de données système est problématique allant de données désalignées jusqu'à des environnements multi-architecturaux utilisant différents types de protocoles de communication. Les intégrateurs sont également confrontés à des défis similaires lors de l'interaction de multiples plates-formes ensemble à travers des environnements de simulation distribuée où chaque plate-forme peut être considérée comme un système avec sa propre interface distincte. D'autre part, permettre la réutilisation de système à travers diverses plates-formes en support aux gammes de produits est un défi pour les fournisseurs de systèmes, car ils doivent adapter leurs interfaces système à des plates-formes hétérogènes faisant donc face aux mêmes difficultés que les intégrateurs. En outre, l'introduction de modifications aux interfaces système afin de répondre aux besoins tardifs d'affaires, ou à des contraintes de performance imprévues, par exemple, est d'autant plus ardue que leurs impacts sont difficiles à prévoir et que leurs effets sont souvent décelés tard dans le processus d'intégration. En conséquence, cette thèse aborde la nécessité de simplifier l'intégration et l'interopérabilité système afin de réduire leurs coûts associés et d'accroître leur efficacité ainsi que leur efficience. Elle est destinée à apporter de nouvelles avancées dans les domaines de l'intégration système et de l'interopérabilité système. Notamment, en établissant une taxonomie commune, et en augmentant la compréhension des interfaces système, des divers aspects impactant les échanges de données système, des considérations des environnements multi-architecturaux, ainsi que des facteurs permettant la gouvernance d'interface ainsi que de la réutilisation système. À cette fin, deux objectifs de recherche ont été formulés. Le premier objectif vise à définir un langage utilisé pour décrire les interfaces système et les divers aspects entourant leurs échanges de données. Par conséquent, trois aspects principaux sont étudiés relatifs aux interfaces système: les éléments de langage pertinents utilisés pour les décrire, la modélisation des interfaces système avec ce langage, et la capture des considérations multi-architecturales. Le second objectif vise à définir une méthode pour automatiser le logiciel responsable des échanges de données système comme moyen pour simplifier les tâches impliquées dans l'intégration et l'interopérabilité système. Par conséquent, les compilateurs de modèles et les techniques de génération de code sont étudiés. La démonstration de ces objectifs apporte de nouvelles avancées dans l'état de l'art de l'intégration système et de l'interopérabilité système. Notamment, ceci culmine en un nouveau langage de description d'interface système, SIDL, utilisé pour capturer les interfaces système et les divers aspects entourant leurs échanges de données, ainsi qu'en une nouvelle méthode pour automatiser le logiciel d'échange de données au niveau système à partir des interfaces systèmes capturées dans ce langage. L'avènement de SIDL contribue également une nouvelle taxonomie fournissant une perspective complète sur l'interopérabilité système ainsi qu'en un langage commun qui peut être partagé entre les parties prenantes, tels que les intégrateurs, les fournisseurs et les experts système. Étant agnostique aux architectures, SIDL fournit un seul point de vue architectural supervisant toutes les interfaces système et capture les considérations multi-architecturales ce qui n'a jamais été réalisé avant ce travail. D'autant plus, un générateur de code SIDL est introduit présentant la nouveauté de générer le logiciel d'échange de données à partir d'un bassin plus riche d'information, notamment à partir des relations système de haut niveau allant jusqu'au bas niveau couvrant les détails protocolaires et d'encodage. En raison des considérations multi-architecturales qui sont capturées nativement dans SIDL, ceci permet au générateur de code d'être agnostique aux architectures le rendant réutilisable dans d'autres contextes. Cette thèse ouvre également la voie à de futures recherches bâtissant sur ses contributions. Elle propose même une vision pour le développement d'applications logicielles avec comme objectif final de repousser encore plus loin les limites de la simplification et de l'automatisation des tâches liées à l'intégration et à l'interopérabilité système.  ABSTRACT: Today's platforms, such as full mission simulators (FMSs), exhibit an unprecedented level of hardware and software system integration. In this context, system integrators face heterogeneous system interfaces which need to be aligned and interconnected together in order to deliver a platform's intended capabilities. The sole aspect of the data systems exchange is problematic ranging from data misalignment up to multi-architecture environments over varying kinds of communication protocols. Similar challenges are also faced by integrators when interoperating multiple platforms together through distributed simulation environments where each platform can be seen as a system with its own distinct interface. On the other hand, enabling system reuse across multiple platforms for product line support is challenging for system suppliers, as they need to adapt system interfaces to heterogeneous platforms therefore facing similar challenges as integrators. Furthermore, the introduction of system interface changes in order to respond to late business needs, or unforeseen performance constraints for instance, is even more arduous as impacts are challenging to predict and their effect are often found late into the integration process. Consequently, this thesis tackles the need to simplify system integration and interoperability in order to reduce their associated costs and increase their effectiveness along with their efficiency. It is meant to bring new advances in the fields of system integration and system interoperability. Notably, by establishing a common taxonomy, and by increasing the understanding of system interfaces, the various aspects impacting system data exchanges, multi-architecture environment considerations, and the factors enabling interface governance as well as system reuse. To this end, two research objectives have been formulated. The first objective aims at defining a language used to describe system interfaces and the various aspects surrounding their data exchanges. Therefore, three key aspects are studied relating to system interfaces: the relevant language elements used to describe them, modeling system interfaces with the language, and capturing multi-architecture considerations. The second objective aims at defining a method to automate the software responsible for system data exchanges as a way of simplifying the tasks involved in system integration and interoperability. Therefore, model compilers and code generation techniques are studied. The demonstration of these objectives brings new advances in the state of the art of system integration and system interoperability. Notably, this culminates in a novel system interface description language, SIDL, used to capture system interfaces and the various aspects surrounding their data exchanges, as well as a new method for automating the system-level data-interchange software from system interfaces captured in this language. The advent of SIDL also contributes a new taxonomy providing a comprehensive perspective over system interoperability as well as a common language which can be shared amongst stakeholders, such as integrators, suppliers, and system experts. Being architecture-agnostic, SIDL provides a single architectural viewpoint overseeing all system interfaces and capturing multi-architecture considerations which was never achieved prior to this work. Furthermore, a SIDL code generator is introduced which has the novelty of generating the data-interchange software from a richer pool of information, notably from the high-level system relationships down to the low-level protocol and encoding details. Because multi-architecture considerations are captured natively in SIDL, this enables the code generator to be architecture-agnostic making it reusable in other contexts. This thesis also paves the way for future research building upon its contributions. It even proposes a vision for software application development with the end goal being to push further the boundaries of simplifying and automating the tasks involved in system integration and interoperability.


identifier: Mouchikhine, V. (2013). Estimation des coûts indirects des bris d'infrastructures souterraines au Québec à travers 3 études de cas  [Mémoire de maîtrise, École Polytechnique de Montréal].

abstract: RÉSUMÉ: L'objectif de cette étude est de faire un état des lieux des coûts socio-économiques liés aux bris d'infrastructures souterraines au Québec. Avec environ 5 bris d'infrastructures souterraines par jour en 2012, uniquement pour la province du Québec, l'étude de l'impact social, mais également économique de cette problématique s'avère être importante. La problématique de l'étude visant à évaluer l'ensemble des coûts reliés à un bris d'infrastructure souterraine nécessitait la définition de ces coûts. Quand nous parlons des coûts liés aux bris d'infrastructures souterraines, il est important de différencier deux grandes familles de coûts. Les premiers sont appelés coûts directs (CD) et représentent les coûts nécessaires à la remise en état des infrastructures touchées lors du bris. Parmi ces coûts, on retrouve le coût des matériaux de remplacement, celui du matériel utilisé et de la main-d'œuvre, mais également le coût de la gestion du projet. À ces CD, il est important d'ajouter la présence de coûts indirects (CI). Ces coûts correspondent à l'évaluation économique de toutes les perturbations ayant un lien plus ou moins important, mais avéré avec le bris. Ils sont variés et peuvent balayer un large éventail de domaines. On y retrouve notamment le coût de la perte de produit et celui lié à l'interruption de service. À cela s'ajoute le coût associé aux diverses interventions de la part des services d'urgence, les coûts dus à la perturbation des sols, ceux engendrés par la fermeture ou la perturbation d'une section de route (congestion, perte de temps, surconsommation, etc.) ainsi que les coûts provenant des impacts environnementaux (bruit, vibrations, pollutions de tous genres). Enfin, nous verrons les coûts liés aux impacts économiques qui s'accompagnent d'une baisse visible de la qualité de vie. Cette étude a été effectuée dans le cadre d'un projet de recherche en partenariat avec Info Excavation, l'Alliance pour la protection des infrastructures souterraines ainsi qu'avec divers propriétaire d'infrastructures souterraines. La collaboration du CIRANO et de Polytechnique Montréal au projet soutenu par Info Excavation, l'Alliance pour la protection des infrastructures souterraines se décompose en plusieurs parties. Nous avons tout d'abord effectué une revue de la littérature et des théories existantes. Les diverses études nous ont permis de définir les différents coûts reliés aux bris d'infrastructures souterraines. Ces études nous ont ensuite permis de regrouper un grand nombre de méthodes de calcul. Ainsi, après avoir réactualisé les différents résultats d'études passées, nous avons pu définir une procédure d'estimation des coûts directs et indirects qui allait être suivie lors de nos différentes études de cas. Le but était de trouver, quel que soit le coût, la méthode d'estimation la plus efficace, mais également la plus explicite. À cette étude théorique sont donc venues s'ajouter 3 études de cas représentatives des bris d'infrastructures souterraines au Québec. Ces 3 études avaient comme principal objectif de regrouper un maximum de type de coûts, mais également être représentatives des préoccupations des différents propriétaires d'infrastructure. Ainsi, l'étude d'un bris d'une conduite de gaz, mais également l'étude d'un bris d'un câble souterrain de télécommunication et l'étude d'une rupture d'une canalisation d'eau potable ont été menées. À travers ces 3 études de cas, un grand nombre de coûts ont été étudiés : le coût des interventions de service d'urgence, les coûts propres à un bris de canalisation de gaz, les coûts d'interruption de service électrique, les coûts liés aux perturbations importantes sur le trafic routier, etc. Les études de cas ont ainsi illustré les notions préalablement développées afin de mettre en lumière l'importance que représentent les CI lors des bris. Nous verrons qu'il n'est pas rare de voir les CI représenter la majorité des coûts totaux. Dans certaines situations, nous montrerons également que les coûts indirects liés à un bris « mineur » peuvent atteindre plusieurs centaines de milliers de dollars. Ce projet a été effectué dans le cadre d'une étude plus large conduite au CIRANO par le groupe Risque. Cette étude a également permis d'évaluer les coûts indirects totaux pour les bris qui sont survenus au Québec en 2012. L'ensemble de ces résultats s'inscrit dans la politique de prévention défendue par Info Excavation, l'Alliance pour la protection des infrastructures souterraines visant à promouvoir les bonnes pratiques d'excavation à suivre. Les résultats de l'étude illustrent l'importance de l'action menée par Info Excavation, l'Alliance pour la protection des infrastructures souterraines. Car si pour un bris d'infrastructure souterraine, les coûts totaux peuvent rapidement atteindre plusieurs dizaines voir plusieurs centaines de milliers de dollars, le coût total annuel lié aux bris d'infra-structures souterraines au Québec pourrait s'élever à plusieurs millions voir plusieurs dizaines de millions de dollars de préjudice.  ABSTRACT: The primary objective of this study is to make an overview of societal costs related to buried infrastructure breakages in Québec. With five infrastructure breakages per day in 2012 for Québec, a study on social and economic costs appears to be a necessity. The objective of the study is to assess the overall costs of a broken underground infrastructure, requires the definition of these costs. When we study costs related to buried infrastructure breakages, we have to discern two main types of costs. The first are called direct costs and represent all the costs necessary for the rehabilitation and the repairing of the affected infrastructures during breaking. These costs include replacement material, hardware, project management, and hourly cost related to labor. With these direct costs, it is important to add the presence of indirect costs. These costs correspond to the economic evaluation of all the disturbances. These disturbances may be linked to the breakage more or less. These costs are varied and can cover a large range of fields. For example, we discern the cost of product lost, service interruptions, and emergency services interventions. Also, we focus on the costs related to the disturbance of the grounds and those due to the disturbance of the road traffic (congestion, deviation, overconsumption, etc). Finally, we see the costs of environmental impacts (noise, vibrations, various pollutions etc.) and economic factors associated with a visible decrease of the life quality.  This study was conducted as part of a research project in partnership with the Alliance for the protection of underground infrastructures (Info Excavation, l'Alliance pour la protection des infrastructures souterraines) as well as various underground infrastructure owners. The collaboration of CIRANO and Polytechnique Montreal for this project, supported by the Alliance, is divided into several parts. Firstly, we conducted a literature review of existing theories. These studies were then allowed us to gather a large number of estimation methods. After refreshing the different results of previous studies, we could define a procedure to estimate the direct and indirect costs that would be followed in our studies. The goal was to find, whatever the cost, the most effective method of estimation, but also the more explicit.  With this theoretical study, we added three case studies representative of breakages underground infrastructure in Québec. These 3 studies had as main objective to combine a maximum of such costs but also be representative of the concerns of the different infrastructure owners. Thus, the study of a broken gas line, but also the study of a broken underground telecommunication cable and the study of a rupture of a drinking water pipeline were conducted. Through these three breakages, a lot of costs were studied: the cost of emergency service interventions, costs specific to a breakage of a pipeline, the costs of electrical service interruption, the costs related to traffic major disruptions, etc. The studies illustrate the concepts previously developed to highlight the importance of representing the indirect costs. We will see that it is not uncommon to find that indirect costs represent the majority of total costs. In some situations, we also show that indirect costs associated with a "minor" breach can reach several hundreds of thousands of dollars. This project was conducted as part of a large study conducted by the CIRANO risk group. This study also assessed the total indirect costs for infrastructure breakages that occurred in Quebec in 2012. These results are part of the prevention policy advocated by the Alliance for the Protection of Underground Infrastructure in Québec to promote good excavation practices. The results of the study illustrate the importance of the Alliance action. As if for an underground infrastructure breakages, total costs can quickly reach several tens or hundreds of thousands of dollars, the total annual cost to breakage of underground infrastructure in Quebec could amount to several  millions or several tens of millions of dollars in damage.


identifier: Guérin, N. (2013). Conception et fabrication d'un séparateur de particules hélicoïdal par impression tridimensionnelle  [Mémoire de maîtrise, École Polytechnique de Montréal].

abstract: RÉSUMÉ: La miniaturisation des appareils médicaux est un domaine en pleine croissance. Les besoins médicaux augmentent en Occident et ailleurs, notamment en raison du vieillissement de la population. De plus, une nouvelle façon de penser la médecine axée sur la prévention prend de l'ampleur. Il en résulte un besoin grandissant d'appareils non seulement portatifs, mais aussi abordables et qui sont simples d'utilisation. Les appareils de diagnostics médicaux sont un bon exemple de ce besoin de miniaturisation. Un appareil diagnostic portatif et abordable aurait des avantages évidents sur l'engorgement des hôpitaux, par exemple. La première étape de la plupart des tests diagnostics est la concentration et la séparation de cellules. Les séparateurs de cellules sont des appareils encombrants pour lesquels la miniaturisation fait l'objet de recherche soutenue. La diélectrophorèse, la force appliquée sur une particule soumise à un champ électrique inhomogène, est une technique prometteuse pour servir de base à la séparation de cellules dans la nouvelle génération d'appareils médicaux portatifs. Le présent mémoire présente le processus de conception et de fabrication d'un séparateur de particules diélectrophorétique tridimensionnel (3D) fabriqué par impression 3D. La méthode d'impression 3D utilisée est l'écriture directe qui consiste en la déposition robotisée de divers matériaux par un processus d'extrusion à travers des embouts à l'échelle micrométrique. Spécifiquement, l'écriture directe a été utilisée pour déposer des matériaux fugitifs qui, une fois encapsulés, sont retirés pour laisser des canaux dans le matériau encapsulant. Deux matériaux ont été testés et le prototype final a été fabriqué en utilisant une encre fugitive faite de gelée de pétrole et de cire microcristalline. Le processus de conception a mené à la fabrication d'un séparateur de forme hélicoïdal par déposition de filaments d'encre fugitive sur des mandrins rotatifs. Une fois assemblés et connectés, ces filaments ont été encapsulés avec de la résine d'époxy et l'encre a été retirée afin de créer des microcanaux dans l'époxy durci. Grâce à son rayon de courbure constant et à sa forme compacte, le séparateur hélicoïdal est 20 % moins encombrant que les séparateurs diélectrophorétiques comparables. Le séparateur a été testé afin de quantifier sa performance et la séparation de particules de polystyrène de 4 et 10 μm de diamètre.  ABSTRACT: The miniaturization of medical devices is a field in rapid expansion. The medical needs of the world are increasing notably because of the population is ageing. Also, a new medicine oriented on prevention is taking hold. The result of these facts is the growing need for portable, affordable and easy to use medical devices. Diagnostic medical devices are a good example of the need for miniaturization. A portable and affordable diagnostic tool would obviously help reduce hospital overcrowding. The first step of most diagnostic test is cell separation and concentration. Current cell separators are bulky and are the focus of an ongoing drive toward miniaturization. Dielectrophoresis, the force applied on a particle submitted to an inhomogeneous electric field, is a promising technique which could be the basis of the next generation of portable medical devices. This dissertation reports the design and fabrication of a three dimensional dielectrophoretic cell separator fabricated using 3D printing. The method used is the direct-write method which consists of the robotic deposition of material by extrusion through micronozzles. Specifically, the direct-write method was used to deposit fugitive materials that were encapsulated and subsequently removed in order to create microchannels in the encapsulating material. Two fugitive materials were tested and the final prototype was fabricated using a fugitive ink made of microcrystalline wax and petroleum jelly. The design process led to the fabrication of a helical-shaped separator by deposition of fugitive ink filaments on rotating spindles. Once assembled and connected, these filaments were encapsulated with epoxy resin and removed. Because of its constant curvature radius and its compact shape, the helical separator had a planar footprint 20% smaller than comparable dielectrophoretic separators. The separator was tested to characterize its performance for the separation of 4 and 10 μm polystyrene particles. Using 900 VDC between the inlet and outlet reservoirs, the separator had efficiencies of 94.0% and 92.5% for the 4 and 10 μm particles, respectively. These results are comparable to reported dielectrophoretic separators. The dissertation then presents tests performed on a second material: polylactic acid. This material has several advantages over fugitive ink however several challenges pertaining to its removal from the encapsulating material remain to be met. These challenges are the subject of a preliminary analysis, the scope of which was limited by the time allotted to the project.


identifier: Cammarata, M. (2013). Facteurs biomécaniques de risques de la cyphose jonctionnelle proximale  [Mémoire de maîtrise, École Polytechnique de Montréal].

abstract: RÉSUMÉ: Les déformations rachidiennes telles que la scoliose sont des pathologies du système musculo-squelettique qui nécessitent un traitement chirurgical d'instrumentation dans les cas de courbures pathologiques sévères (angle de Cobb > 40° pour les cas de scoliose) (Weinstein 2001; Morcuende and Weinstein 2003). Cette intervention d'instrumentation consiste à fixer des implants sur les vertèbres et redresser le rachis à l'aide de tiges métalliques, ce qui mène à la fusion permanente du rachis. Bien que ce traitement permette une correction efficace des courbures pathologiques du rachis (Weinstein 2001), la survenue de complications postopératoires peut parfois entraîner une révision de l'instrumentation. La première cause de révision est la cyphose jonctionnelle proximale (CJP) (Schairer, Carrer et al. 2013), avec une prévalence entre 20% et 43% (Yang and Chen 2003; Yagi, King et al. 2012). La CJP se manifeste comme une hypercyphose des vertèbres adjacentes au-dessus de l'instrumentation. Plusieurs études rétrospectives ont été réalisées afin d'en identifier les causes. Les facteurs de risque associés à la survenue et à la progression de la CJP incluent la dissection proximale des tissus mous postérieurs, la dégénérescence de la capsule articulaire, l'équilibre sagittal pré- et postopératoire, la thoracoplastie, la qualité osseuse, l'obésité et la raideur de l'instrumentation (Glattes, Bridwell et al. 2005; Kim, Bridwell et al. 2005; DeWald and Stanley 2006; Kim, Lenke et al. 2007; Yagi, King et al. 2012). Ainsi, on rapporte que la CJP pourrait être associée au nombre de vertèbres instrumentées, au type d'implant proximal ou de manière plus générale à la configuration de l'instrumentation au niveau de la vertèbre proximale instrumentée. Les pathomécanismes de la CJP demeurent toutefois encore controversés. En effet, les conclusions rapportées dans la littérature sont parfois contradictoires et n'arrivent pas à isoler l'effet spécifique d'une variable donnée par rapport à la CJP. En outre, aucune étude biomécanique n'a rapporté l'impact biomécanique de différentes variables de la chirurgie rachidienne sur les indices géométrico-mécaniques reliés à la CJP. L'objectif de ce projet de maîtrise a donc été de développer un modèle biomécanique de la chirurgie d'instrumentation afin d'analyser et comprendre les pathomécanismes postopératoires du segment jonctionnel proximal du rachis. Six variables chirurgicales pouvant augmenter potentiellement le risque de survenue de la CJP ont ainsi été analysées.  ABSTRACT: Spinal deformities such as scoliosis are a group of musculoskeletal disorders requiring surgical instrumentation in cases of severe pathological curvatures (e.g. Cobb angle > 40° for scoliosis) (Weinstein 2001; Morcuende and Weinstein 2003). Spinal instrumentation is a surgical procedure that stabilizes the spine and fuses vertebrae with implanted devices, such as metallic rods, screws and hooks. Although this treatment allows effective correction of pathological spinal curvatures (Weinstein 2001), the occurrence of postoperative complications can sometimes lead to a revision of the instrumentation. The first cause of revision surgery is the proximal junctional kyphosis (PJK) (Schairer, Carrer et al. 2013), having a prevalence between 20% and 43% (Yang and Chen 2003; Yagi, King et al. 2012). PJK appears as a hyperkyphosis of non instrumented proximal vertebrae. Several retrospective studies have been conducted to identify its causes. Risk factors related to PJK occurrence and progression include the proximal dissection of the posterior soft tissues, the joint capsule degeneration, the pre- and postoperative sagittal balance, the thoracoplasty, the bone quality, the obesity and the stiffness of the instrumentation (Glattes, Bridwell et al. 2005; Kim, Bridwell et al. 2005; DeWald and Stanley 2006; Kim, Lenke et al. 2007; Yagi, King et al. 2012). It is also reported that PJK could be associated to the number of instrumented vertebrae, the type of proximal implant or the construct configuration at upper instrumented vertebra. However, pathomechanisms of PJK are still controversial because findings reported in the literature are sometimes contradictory and not able to isolate the effect of a specific variable on PJK. In addition, no computational study has reported the impact of several surgical variables on biomechanical indices related to PJK. The objective of this Master project was therefore to develop a biomechanical model of spinal instrumentation in order to analyze and better understand the postoperative pathomechanisms of proximal junctional spinal segment. Six surgical variables potentially increasing the risk for PJK occurrence have been analyzed. In order to achieve this objective, a multibody model was developed and validated to computationally simulate surgical instrumentations of six adult patients affected by PJK. For each case, the spinal tridimensional geometry was reconstructed using two calibrated preoperative radiographs (postero-anterior and lateral). In these models, each vertebra was


identifier: Güney, M. (2013). Toxic Elements in Toys and Children's Low-cost Jewelry: Occurrence, Bioaccessibility, and Risks from Oral Exposure  [Thèse de doctorat, École Polytechnique de Montréal].

abstract: RÉSUMÉ: La contamination des jouets et des bijoux de fantaisie destinés aux enfants par des éléments potentiellement toxiques est un problème courant. Les enfants peuvent être exposés aux jouets et aux bijoux qui peuvent contenir du Pb, du Cd ou d'autres métaux et métalloïdes toxiques par voie d'exposition orale. Le problème de contamination des bijoux et des jouets et la possibilité d'exposition des enfants à ces produits ont déjà été évalués dans une certaine mesure dans la littérature. En résumé, l'exposition devrait avoir lieu en raison du contact avec la bouche, qui est spécifique aux enfants. Plus précisément, les enfants pourraient être exposés aux éléments potentiellement toxiques dans les jouets et les bijoux pour enfants par (1) la mobilisation dans la salive suite au contact prolongé avec la bouche ou par (2) la mobilisation dans le système gastro-intestinal suite à l'ingestion des jouets ou des bijoux. Cependant, la bioaccessibilité orale des éléments potentiellement toxiques trouvés dans les jouets et les bijoux de fantaisie n'a pas encore été complètement évaluée, le potentiel d'exposition des enfants aux éléments toxiques dans les articles contaminés n'a pas été estimé et les risques n'ont pas encore été caractérisés.  ABSTRACT: Contamination of toys and low-cost jewelry with potentially toxic elements is a widespread problem. Children can be orally exposed to toys and children's jewelry that contain Pb, Cd, and other toxic metals and metalloids. Contamination problem in jewelry and toys, and possibility of children's exposure to these items have been previously investigated to some extent in the literature. Exposure may occur via oral pathway as a result of common child-specific behavior of object mouthing. The oral exposure may lead toxic elements to become bioavailable. More specifically, children can be exposed to potentially toxic elements in toys and children's jewelry (1) via saliva mobilization following mouthing, or (2) via mobilization in the gastro-intestinal tract following ingestion of toy or jewelry material. However, oral bioaccessibility of elements in toys and inexpensive jewelry has not yet been fully evaluated, and children's potential exposure has not been characterized.


identifier: Sheikholeslami, Z. (2013). Comprehensive Characterization of an Inducible Mammalian Expression System Using 13C-Metabolic Flux Analysis  [Thèse de doctorat, École Polytechnique de Montréal].

abstract: RÉSUMÉ: La culture de cellules de mammifères constitue à ce jour la plateforme d'expression la plus utilisée dans l'industrie biopharmaceutique, en raison de la capacité inégalée de ces cellules à réaliser les modifications post-traductionnelles essentielles à la fonctionnalité des produits complexes. En raison de la forte demande pour les produits biothérapeutiques, de la volonté de diminuer les coûts associés au développement des bioprocédés et du besoin de réduire les temps de mise en marché, plusieurs progrès réalisés au cours des dernières décennies ont permis des améliorations significative en termes de rendement et de qualité du produit. Ces avancées ont été effectuées surtout grâce au développement de meilleurs vecteurs d'expression, au développement de milieux de culture plus performants et à l'application de stratégies fed-batch permettant l'atteinte de très hautes densités cellulaires. Une autre avancée récente concerne le développement de systèmes d'expression inductibles, dont l'énorme avantage est de permettre de découpler les phases de croissance et de production, conférant ainsi la possibilité d'optimiser chacune des phases indépendamment, avec des conditions opératoires spécifiques à chacune d'elles. Par ailleurs, cela permet en principe de faire croître les cellules plus rapidement avant la phase d'induction, puisque ces dernières n'ont pas à supporter la charge métabolique additionnelle qu'impose la synthèse d'une protéine recombinante. Dans de tels procédés bi-phasiques, établir le moment propice pour procéder à l'induction et élaborer une stratégie d'alimentation postinduction efficace sont deux facteurs cruciaux qui vont dicter la productivité du système. En raison de la complexité du métabolisme des cellules de mammifères, l'optimisation ciblée des procédés de culture demeure un défi, mais ce travail peut être grandement facilite par le biais de nouvelles approches du génie métabolique. C'est le cas notamment de la technique d'analyse des flux métaboliques avec traceurs isotopiques (13C-MFA), qui a démontré qu'elle permet une caractérisation de l'état physiologique à la fois plus fine et plus robuste, mais qui a toutefois encore peu été exploitée dans le contexte de la culture de cellules animales. L'objectif principal de cette thèse était donc d'appliquer la technique d'analyse des flux métaboliques avec traceurs isotopiques afin d'effectuer une caractérisation quantitative du métabolisme primaire de cellules CHO dotées d'un système d'expression inductible, afin de permettre l'établissement systématique des principales conditions de culture et le développement rationnel d'une stratégie d'alimentation post-induction. A cette fin, des protocoles expérimentaux vii pour effectuer des expériences de marquage et des analyses par spectrométrie de masse, ainsi que les outils de calcul requis pour effectuer l'estimation des flux intracellulaires à partir de ces mesures ont du être développés ou adaptés à partir de méthodes décrites dans la littérature. En premier lieu, l'approche a été utilisée afin d'analyser le métabolisme central du carbone d'une lignée de cellules CHO en lien avec la productivité cellulaire spécifique. L'objectif était d'évaluer de façon quantitative la charge imposée par la synthèse d'une protéine recombinante sur le métabolisme primaire des cellules. Ceci a été accompli par le biais d'une analyse comparative des flux métaboliques pour des cellules induites et non-induites. Des cultures avec divers substrats marqués au C13 ont été réalisées et les distributions de masse résultantes de plusieurs métabolites extracellulaires (lactate et trois acides aminés) ont été mesurées. Ces données ont été utilisées, de concert avec des mesures de taux spécifiques de consommation et de production, pour calculer les flux métaboliques. Cette analyse a notamment révélé que l'expression d'une protéine recombinante est associée avec des différences faibles, mais néanmoins significatives pour plusieurs voies métaboliques, particulièrement celles reliées à la formation d'ATP et de NADPH, tel que le cycle de Krebs, la voie des pentose phosphate ou la voie de l'enzyme malique. Les cellules induites présentaient un métabolisme plus efficace, puisqu'une plus grande proportion du glucose, le nutriment principal, était acheminée dans le cycle TCA. A l'inverse, aucun changement majeur n'a été détecté au niveau du métabolisme des acides aminés, dont la glutamine. Comme un changement de température a été opéré au moment de l'induction pour favoriser la productivité, cette étude se voulait également la première caractérisation détaillée du métabolisme des cellules CHO sous des conditions légèrement hypothermique. Par la suite, l'impact du moment d'induction sur la productivité des cultures a été étudié, puisque ce paramètre influe à la fois sur la quantité de biomasse et sur la productivité spécifique des cellules. A cette fin, des cellules ont été prélevées à différents stades de croissance, puis ont été transférées pour être induites dans du milieu frais. Les cinétiques de croissance, de consommation et de production durant la phase de production ont été comparées pour l'ensemble des conditions d'induction. En comparaison avec les cultures induites à concentrations élevées, les cellules induites à faibles densités cellulaires ont atteint un pic de concentration plus faible, mais la longévité des cultures et la productivité spécifique des cellules étaient plus élevées, ce qui s'est traduit par une augmentation de la concentration finale en produit. Afin de mieux caractériser les effets observés sur le plan physiologique, une analyse des flux métaboliques par viii traceurs isotopiques a été réalisée pour comparer les cultures induites respectivement à faible et à haute densité cellulaire. Pour cette étude, le nombre de mesures a été étendu en considérant également les distributions de masse de deux acides organiques. En accord avec les différences observées au niveau de la croissance et de la productivité cellulaire, il a été constaté que plusieurs flux intracellulaires sont affectés par le moment d'induction. Il en a été conclu que la disponibilité des nutriments avait un impact marqué durant la phase de production après induction. Plus particulièrement, il a été révélé que le glucose est consommé plus efficacement dans le cas des cultures à haute densité, alors que la contribution des acides aminés s'en trouvait, elle, diminuée. Les résultats précédents ont été obtenus pour un changement de milieu complet au moment de l 'induction, une opération qui ne serait pas aisément transposable pour la production à grande échelle. Pour cette raison et parce que la disponibilité des nutriments semblent avoir un impact majeur sur la productivité et/ou la croissance, la possibilité d'augmenter les rendements par le biais d'une stratégie fed-batch a été explorée. Il a été constaté que des ajouts de solutions concentrées effectués post-induction augmentaient de façon substantielle la productivité des cultures par rapport au mode batch. Plus encore, il a été observé que lorsque la glutamine est alimentée en excès, les cultures atteignent des concentration cellulaires maximales plus grandes. Cependant, les cultures limitées en glutamine présentaient elles une productivité spécifique plus grande, ce qui a conduit à des rendements en produit similaires. Afin de mettre en lumière l'impact physiologique du niveau de glutamine dans l'alimentation, une étude comparative des flux métaboliques avec traceurs isotopiques a été réalisée dans des cultures en mode semicontinu. Les changements majeurs en terme de croissance et de productivité se traduisaient également par des différences observables au niveau de la distribution des flux métaboliques. Plus particulièrement, le métabolisme du lactate était grandement influencé par le niveau de glutamine alimenté aux cellules durant la phase d'induction. Globalement, l'ensemble des travaux réalisés semble suggérer une corrélation inverse entre le taux de croissance et la productivité spécifique des cellules. Les caractérisations métaboliques effectuées pourraient néanmoins procurer une bonne base pour l'identification de marqueurs physiologiques de la productivité, permettant ainsi de poursuivre le développement et l'optimisation des procédés avec induction. Ces travaux démontrent également la valeur de la technique de 13C-MFA comme outil de caractérisation du métabolisme.  ABSTRACT: Mammalian cell cultures have become the predominant production platform in today's multibillion dollar biopharmaceutical industry. Mammalian cells have the unique capacity to synthesize recombinant proteins with proper folding and post-translational modifications. Due to the increasing demand for biotherapeutics, the pressure to reduce the costs associated with process development and the need to shorten the time to market, continuous efforts have been made in mammalian cell technologies to maximize both the product yields and quality. This has been mostly achieved through the design of enhanced expression vectors, improved medium formulations and the application of fed-batch strategies supporting high cell densities. In recent years, there has been also a growing interest in the development of inducible mammalian expression systems, which allow decoupling of the growth and production phases and open up the possibility to define specific operating conditions that are favorable for each phase. Moreover, cells can presumably be grown more rapidly before induction, as they do not have the extra metabolic burden associated with recombinant protein expression. In such biphasic systems, a suitable timing for induction and an efficient feeding protocol pre/post-induction are among the most crucial factors to ensure a high volumetric productivity. Due to the complex metabolism of mammalian cells, the targeted optimization of cell culture processes remains challenging, but can be greatly facilitated with the aid of new metabolic engineering approaches. In particular, the use of isotopic tracers and 13C-metabolic flux analysis (13C-MFA) was shown to provide a more detailed and accurate description of cellular physiology than the classical metabolite balancing technique, although its application to mammalian cells is still in its infancy. The main objective of this work was thus to apply 13C-metabolic flux analysis to quantitatively characterize the primary metabolism of recombinant CHO cells harboring an efficient inducible expression system, as a systematic approach to guide the determination of key process conditions and allow the rational development of a feeding protocol to increase culture productivity. To this end, analytical methods for conducting informative labeling experiments and mass spectrometry measurements, as well as computational tools allowing reliable metabolic flux quantification had to be developed or adapted from the literature. First, this method was used to analyze the central carbon metabolism of a recombinant CHO cell line in relation with cellular productivity. The goal was to quantitatively evaluate the burden x imposed by recombinant protein expression on the primary metabolism of cells in culture. This was achieved by conducting a comparative study of the intracellular flux map distribution with and without the induction of recombinant protein expression. We performed cultures with multiple 13C-labeled substrates and measured the resulting mass distribution of extracellular metabolites (lactate and three amino acids) by mass spectrometry. This additional data was used in conjunction with extracellular rate measurements to obtain reliable metabolic flux estimates. Through this analysis, we have notably demonstrated that heterologous protein expression is correlated with small, but significant differences in a number of important intracellular pathways, most of them related to ATP and NADPH formation, including the pentose phosphate pathway, the malic enzyme reaction and the TCA cycle. Induced cells were found to exhibit an increased flux of pyruvate into the TCA cycle, indicative of a more efficient glucose utilization. However, no significant difference could be inferred with respect to amino acid metabolism, including glutamine. Since a temperature shift was performed at the time of induction, this study was also the first comprehensive characterization of CHO cell metabolism under mild-hypothermia conditions. We have then investigated the impact of the timing of induction on culture productivity, since this parameter can affect both the cumulative biomass concentration and the cell specific productivity. Cells taken at different stages of growth were transferred and induced in fresh medium and the kinetics of growth, nutrient consumption and product formation were compared during the production phase. Compared to cultures induced at a high cell concentration, low cell density inductions achieved lower maximum cell concentrations, but exhibited higher cell specific productivity and greater culture longevity, which gave a greater final product titers. To gain more physiological insights into the observed differences, 13C-metabolic flux analysis was performed to characterize and compare the metabolism of cells induced at respectively low and high cell densities. The range of measurements was extended by including the mass distributions of two organic acids. In line with differences observed in terms of growth and productivity, several calculated intracellular fluxes were found to be affected by the timing of induction. It was inferred that the corresponding availability of nutrients had a determinant impact on the induction phase. Most notably, glucose utilization efficiency was increased in high cell density induction, whereas the contribution of amino acids became marginal. xi The previous results were however obtained by doing a complete medium exchange at the time of induction, an operation which cannot be easily implemented at large-scale. For this reason and since the results implied a strong correlation between nutrient availability and cellular growth/productivity, we then explored the possibility to increase the product yield by using a fedbatch process. We found that performing concentrated feed additions post-induction greatly increase the productivity of cultures compared to induction in batch mode. More interestingly, we observed that when glutamine was fed in excess to the cells, the cultures reached greater maximum cell concentrations. While cell growth was comparatively lower in glutamine-limited fed-batch, the final product titers were found to be similar, indicative of an increased cell specific productivity. To further assess the physiological impact of glutamine levels on the cells, a comparative 13C-metabolic flux analysis was conducted in semi-continuous cultures to analyze both culture regimes. The marked changes in cellular growth and productivity were clearly reflected in the metabolism of the cells. In particular, lactate metabolism was found to be greatly influenced by the amount of glutamine present in the feed during the production phase. Overall, the results from all our studies tend to suggest that there may be some negative correlation between cell growth and cellular productivity. Nonetheless, the metabolic characterizations performed in this work may provide useful clues for the identification of physiological markers of cell growth and/or productivity that could further guide the optimization of inducible expression systems. Our work also demonstrates that 13C-metabolic flux analysis is a valuable tool for characterizing cell metabolism and supporting cell culture process optimization.


identifier: Ghodratnama, M. (2013). Dynamics, Control and Extremum Seeking of the Rectisol Process  [Mémoire de maîtrise, École Polytechnique de Montréal].

abstract: RÉSUMÉ: Pendant la dernière décennie, les bioraffineries basées sur la gazéification ont fait l'objet de nombreuses études dans le cadre des efforts mondiaux visant à remplacer les combustibles fossiles qui produisent de l'énergie et des produits chimiques à valeur ajoutée. Une partie importante de ces bioraffineries est l'unité de purification des gaz de synthèse issus de l'oxydation partielle, qui enlève le CO2 et l'H2S. Un des procédés de purification considéré dans ces études est le Rectisol. Ce procédé est utilisé car il est plus environnemental et requière moins de coûts d'investissement et d'opération par rapport à d'autres procédés similaires. Afin de faire l'étude dynamique de ce procédé, une simulation en régime permanent à d'abord, été menée à l'aide du logiciel Aspen plus R.  ABSTRACT: Gasification based biorefineries have been studied in the past decade as part of a global e↵ort to replace fossil fuels to produce energy and added value chemicals. An important part of these biorefineries is the acid gas removal units, that remove CO2 and H2S from the produced synthesis gas. One of the acid gas removal processes associated in these studies is Rectisol. Rectisol has been chosen since it's environmental friendly and requires a lower amount of operational and capital costs compared to its opponents. To carry out a dynamic study of the process, as a first step, a steady-state simulation was carried out in Aspen Plus R


identifier: Lessard, I. (2013). Détermination de la toxicité à long-terme du zinc sur la diversité fonctionnelle enzymatique de sols contaminés collectés sur le terrain  [Thèse de doctorat, École Polytechnique de Montréal].

abstract: RÉSUMÉ: L'évaluation de l'impact potentiel écotoxique des métaux en analyse de cycle de vie (ACV) repose sur des données générées lors de tests de toxicité en laboratoire et archivées dans des banques de données spécialisées en écotoxicologie. Or, peu de données sont disponibles pour les écosystèmes terrestres et celles-ci sont généralement issues de tests sur les plantes ou les invertébrés du sol, ce qui ne couvre pas assez de catégories d'organismes pour bien représenter l'écosystème. De plus, les données disponibles sont souvent inadaptées au contexte de contamination métallique et sont généralement obtenues sur des sols artificiellement contaminés en laboratoire. Par conséquent, l'impact écotoxique potentiel des métaux en ACV est mal modélisé et non représentatif des contaminations réelles. Il faut donc générer rapidement des données écotoxiques qui tiennent compte des particularités d'une contamination métallique et qui proviennent d'une autre catégorie d'organismes terrestres peu représentée en écotoxicologie. La communauté microbienne terrestre présente ainsi plusieurs atouts puisqu'elle est en contact direct avec le sol et qu'elle est indigène. De tous les indicateurs microbiens existants, l'évaluation des réponses enzymatiques du sol est une avenue intéressante puisque les enzymes sont à la base des processus métaboliques et des cycles biogéochimiques des organismes vivants, elles sont produites principalement par la communauté microbienne et elles sont sensibles aux métaux. De plus, l'agrégation des réponses de plusieurs enzymes du sol pourrait conduire à un indice de diversité fonctionnelle (DF) enzymatique, un attribut de pertinence écologique de plus en plus encouragé dans les études des services écosystémiques.  Cependant, dans le contexte d'une contamination métallique de terrain, la communauté microbienne peut développer des mécanismes de tolérance (adaptation génétique ou acclimatation physiologique) rendant l'activité enzymatique apparente des sols contaminés non corrélée au métal. Dans ce cas particulier, il faut trouver une autre approche écotoxicologique pour évaluer les réponses enzymatiques des sols contaminés par les métaux collectés sur le terrain. La stabilité enzymatique des sols, basée sur la dynamique de récupération de l'activité enzymatique suite à une perturbation contrôlée en laboratoire, est une approche de plus en plus promue en écologie microbienne et pourrait être plus sensible aux métaux que l'approche classique basée sur l'activité enzymatique. Il faut donc étudier ces deux approches enzymatiques (activité vs stabilité) pour voir celle qui est la plus adaptée au contexte du projet. Le métal testé pour ce projet est le zinc (Zn). L'objectif principal du projet porte sur le développement d'une méthodologie écotoxicologique basée sur la diversité fonctionnelle enzymatique agrégée et sensible à la concentration de Zn dans des sols contaminés collectés sur le terrain. Les objectifs spécifiques sont: 1) Sélectionner la solution d'incubation assurant des résultats enzymatiques justes et optimaux dans le contexte d'une contamination métallique 2) Élaborer un score de stabilité enzymatique qui tient compte des particularités physico-chimiques propres à chaque site échantillonné tout en étant sensible au Zn et 3) Générer une donnée écotoxique à partir d'un indice de diversité fonctionnelle enzymatique agrégé (activité ou stabilité) bien corrélé  (R2  0,50) au Zn de sols contaminés. SOLUTION D'INCUBATION DES ESSAIS ENZYMATIQUES Le premier objectif spécifique du projet consistait à s'assurer que les essais enzymatiques génèrent des résultats représentatifs de ceux observés sur le terrain (in situ) et à vérifier si l'eau peut substituer l'utilisation de solutions tampon. Cette section a conduit à la rédaction du premier manuscrit intitulé “ Metal toxicity assessment in soils using enzymatic activity : Can water be used as surrogate buffer? ˮ et publié dans la revue Soil Biology & Biochemistry (chapitre 3).  En effet, dû à l'effet ubiquitaire du pH sur 1'activité enzymatique, la composition de la solution de sol et la spéciation des métaux, il fallait préliminairement s'assurer que la solution d'incubation utilisée ne modifie pas la toxicité in situ du Zn des sols collectés sur le terrain et qu'elle n'entraine pas de fluctuation de pH durant les essais. Trois étapes allaient répondre à ce but : 1) Quantifier le Zn labile (une forme  biodisponible) des échantillons du sol après contact avec différentes solutions d'incubation utilisées dans les essais enzymatiques (différents tampons et eau), 2) Mesurer à intervalles réguliers le pH des échantillons durant les essais enzymatiques conduits dans l'eau et 3) Comparer les essais conduits de façon standard dans un tampon à ceux conduits en parallèle dans de l'eau.  Les résultats de cet objectif sont présemtés dans le chapitre 3 et la section 6.1. Ils ont montré qu'une seule solution d'incubation, le tampon acétate pH 5,8 utilisé dans les essais standards de l'arylsulfatase, augmentait considérablement la concentration du Zn labile après 2 h de contact, temps correspondant à la durée des essais enzymatiques. Cependant, même si cette concentration est 10 à 50 fois plus élevée que celle mesurée dans l'eau ou les autres tampons, elle n'affecte pas l'activité de l'arylsulfatase à court terme (2 h) puisque l'activité de l'arylsulfatase dans le tampon acétate est très similaire à son activité dans l'eau. De plus, le pH des échantillons mis en contact avec de l'eau n'a pas significativement fluctué comparativement au pH des échantillons mis en contact avec le tampon usuel. Finalement, l'activité enzymatique obtenue en utilisant le tampon est généralement bien corrélée (c.-à-d. R2 élevé) à celle obtenue en utilisant de l'eau à l'exception de deux enzymes, l'uréase et la phosphatase alcaline, utilisant des tampons standards à pH alcalins (pH 10 et pH 11 respectivement). Par conséquent, l'utilisation de l'eau comme substitut aux tampons est justifiée, non pas parce que les tampons modifient la biodisponibilité du Zn et ainsi sa toxicité, mais plutôt parce que des conditions d'incubation standards loin des conditions réelles de terrain engendrent des résultats incertains et, qui plus est, non optimaux. SCORE DE STABILITÉ ENZYMATIQUE ADAPTÉ AU CONTEXTE MÉTALLIQUE Le deuxième objectif spécifique du projet consistait à cibler le score de stabilité enzymatique (SE) le plus sensible à une contamination réelle au Zn sur le terrain et a conduit à la rédaction du deuxième manuscrit intitulé “ Linking Zn co-tolerance to soil enzymes resilience by a RSSI-based functional stability score ˮ et soumis dans la revue FEMS Microbiology Ecology (chapitre 4). Une méthode SE intéressante était la méthode RSSI (Relative Soil Stability Index), car elle est la première à avoir considéré la dynamique de la récupération à l'intérieur de son score et elle est basée sur l'activité enzymatique du sol. Mais d'abord, il fallait modifier le score original RSSI pour y intégrer l'historique physico-chimique du site échantillonné car il s'agissait d'une lacune majeure du score original. Trois nouveaux scores ont ainsi été développés. Ici aussi, trois étapes allaient répondre à l'objectif spécifique de cette partie : 1) Normaliser le score RSSI par le sol de référence, perturbé ou non, 2) Déterminer le score SE le plus sensible au Zn en corrélant ces nouveaux scores et ceux déjà existants aux concentrations de Zn des sols et 3) Faire une analyse multivariée pour vérifier quelles propriétés physico-chimiques influencent le score SE sélectionné.  Les résultats de cette partie sont présentés dans le chapitre 4. Le meilleur score SE est un des nouveaux scores intégrant l'historique du site d'échantillonnage, soit le RSSIb. Ce score a détecté la toxicité du Zn sur trois enzymes individuelles (arylsulfatase, protéase et uréase) alors que les autres scores n'ont détecté la toxicité du Zn que sur une enzyme (variable selon le score). Les concentrations biodisponibles de Zn (labile et soluble) ont généré les plus fortes régressions, alors que la concentration totale de Zn n'était pas bien corrélée au RSSIb. Les résultats statistiques ont montré que le score RSSIb était fortement corrélé (négativement) à la concentration de Zn labile (et de façon moindre à la concentration de Zn soluble) du sol et que la texture et le pH étaient modérément corrélés au RSSIb. Les autres propriétés (concentration de carbone organique total ou dissout, capacité tampon, capacité d'échange cationique et concentration total de Zn) ont très peu influencé la SE du sol évaluée par le score RSSIb. La SE du sol évaluée par le score RSSIb est donc un bon indicateur de toxicité du Zn des sols contaminés, car le RSSIb dépend principalement du contenu en Zn biodisponible du sol.  INDICE DE DIVERSITÉ FONCTIONNELLE ENZYMATIQUE Le troisième objectif spécifique du projet consistait à développer un indice de diversité fonctionnelle enzymatique sensible au Zn et a conduit à la rédaction du troisième manuscrit intitulé “ Toxicity response of a new enzyme-based functional diversity methodology for Zn contaminated field-collected soils ˮ et soumis dans la revue Soil Biology & Biochemistry (chapitre 5). Parallèlement, il fallait vérifier quelle approche, l'activité enzymatique classique ou la stabilité enzymatique évaluée par le score RSSIb agrégé, était la plus sensible au Zn et la plus judicieuse d'un point de vue pratique. Quatre étapes allaient répondre à l'objectif spécifique de cette partie : 1) Développer un indice de diversité fonctionnelle statistiquement valide basé sur l'agrégation de résultats enzymatiques (activité et stabilité) 2) Calculer les indices de DF ciblés pour chaque sol contaminé au Zn et pour chacune des deux approches enzymatiques 3) Corréler ces indices de DF aux différentes concentrations de Zn des sols afin de générer une donnée écotoxique et 4) Comparer les données et les paramètres de régression obtenus par les 2 approches enzymatiques et identifier celle qui est la plus pertinente pour évaluer la DF. La démarche d'agrégation utilisée a été validée statistiquement par une analyse en composantes principales montrant qu'au moins 75% de la variabilité enzymatique pouvait être expliquée par la première composante principale, justifiant ainsi l'agrégation de ces 6 variables (réponses enzymatiques) en un seul indice DF. Plusieurs indices DF ont été testés, mais ce sont les moyennes pondérée et géométrique des résultats enzymatiques qui se sont avérées les plus fiables comparativement aux autres indices (Shannon, Simpson et Gini). De plus, la diversité fonctionnelle enzymatique des sols contaminés par le Zn s'est montrée sensible à un gradient de Zn biodisponible (soluble et labile). Finalement, l'activité enzymatique agrégée demeure aussi bien corrélée à un gradient de Zn soluble ou labile que la stabilité enzymatique agrégée et ce, même après plusieurs années d'exposition. Ainsi, bien que l'utilisation du concept de stabilité enzymatique ait été judicieuse et réfléchie, elle n'a pas apporté de valeur ajoutée à l'évaluation de la toxicité du Zn par l'agrégation des résultats enzymatiques.  CONCLUSION Globalement, la thèse a permis de définir les bases d'une méthodologie d'évaluation de toxicité terrestre in situ adaptée à une contamination de Zn à long terme et basée sur la diversité fonctionnelle enzymatique, un attribut de pertinence écologique très promu. Cette méthodologie pourrait être utilisée pour d'autres contaminants métalliques de sorte à générer d'autres données écotoxiques afin d'ultimement améliorer la modélisation de l'impact potentiel toxique des métaux en ACV.  ABSTRACT: INTRODUCTION The potential ecotoxic impact assessment of metals in life cycle assessment (LCA) requires data generated from ecotoxicological tests and recorded in specialized databases. However, there is a lack of available terrestrial data and when available, it is mainly obtained from plants and soil invertebrates, which is insufficient to adequately represent the terrestrial ecosystem. Moreover, the available data are not adapted to a metallic contamination context and are generated from tests conducted on laboratory-spiked soils instead of field-contaminated soils. Therefore, modeling the potential toxic impact of metals raises several issues and highlights the pressing need to generate more representative data from a category of terrestrial organisms rarely used in ecotoxicology. The soil microbial community shows many advantages in this context since it is in direct and complete contact with soil and it is indigenous. Among existing microbial indicators, soil enzymatic activity is particularly interesting since enzymes are pre-requisites of metabolic pathways and biogeochemical cycles, are mainly produced by the soil microorganisms and are metal-sensitive. Furthermore, the aggregation of enzymatic responses of many soil enzymes could lead to a functional diversity (FD) index, which is an attribute of ecological relevance increasingly promoted for studying ecosystemic services. However, in a metal field contamination context, the microbial community may develop tolerance mechanisms by genetic adaptation or physiological acclimation, yielding apparent soil enzymatic activity uncorrelated to metal concentrations. In this case, it is necessary to find an alternative approach to assess the enzymatic responses to metal contamination. The enzymatic stability, based on the resilience dynamic of the enzymatic activity after a laboratory-controlled disturbance, is an approach increasingly encouraged in microbial ecology and may be more metal sensitive than the traditional enzymatic activity approach. These two approaches need to be studied in order to establish which is the most adapted for the study of metal-contaminated field soil. Zinc was selected for this project. The aim of this project is to develop a long-term, Zn-sensitive, ecotoxicological methodology based on the aggregated enzymatic functional diversity in field-contaminated soils. The specific objectives are to: 1) Select the incubation solution ensuring optimal and accurate enzymatic results in a metallic contamination context; 2) Elaborate an enzymatic stability score which takes into account the physicochemical history of the sampled site and which is Zn-sensitive and; 3) Generate new ecotoxicological data from an aggregated enzymatic functional diversity (activity or stability) which is well-correlated (i.e. R2 > 0.50) to Zn concentrations of field-contaminated soils. INCUBATION SOLUTION FOR ENZYMATIC ASSAYS The first specific objective of the project was to validate that the enzymatic assays generate representative results from those observed on the field and verify whether water could substitute the buffer in an incubation solution. This section led to the first manuscript (chapter 3), which has been accepted in the Soil Biology & Biochemistry journal. Due to the pH affecting simultaneously the enzymatic activity, the metal speciation and the soil solution composition, it was necessary to ensure that the incubation solution did not modify the in situ Zn toxicity of field soils and that the pH remained stable during the enzymatic assays. Three main steps were required to reach this objective: 1) Measure the labile Zn concentration of soil samples in contact with different incubation solutions used for enzymatic assays (buffers and water); 2) Measure at regular intervals sample pH of enzymatic assays conducted in water and; 3) Compare the enzymatic assays conducted in buffer to those conducted in water. The results of this objective are recorded in chapter 3. They showed that only one incubation solution, the acetate buffer pH 5.8 used in the standard enzymatic assays related to arylsulfatase, considerably increased the labile Zn concentration after a contact time of 2 h, corresponding to the incubation time of the enzymatic assays. However, although this concentration was 10 to 50 times higher than the one measured in water or the other buffers, it did not affect the short-term response of arylsulfatase since its activity conducted in its buffer was similar to its activity conducted in water. Additionally, the pH of enzymatic samples conducted in water did not significantly fluctuate compared to the pH of those conducted in buffers. Finally, the enzymatic assays conducted in water were well-correlated (i.e.  R2 > 0.80) to those conducted in buffers, except for two enzymes, urease and alkaline phosphatase, which both used buffers at pH 10 and pH 11 respectively. Therefore, water may be used as a surrogate incubation solution, not because the buffers modify the metal speciation and toxicity but rather because standard incubation pH, which is far from pH observed in field soils, generates uncertain and non-optimal enzymatic results.  ENZYMATIC STABILITY SCORE ADAPTED TO A METALLIC CONTAMINATION The second specific objective of this project was to select the most Zn-sensitive enzymatic stability (ES) score and led to the second manuscript (chapter 4) submitted to the FEMS Microbiology Ecology journal. One interesting ES method is known as the Relative soil stability index (RSSI) method. It was the first enzyme-based method to take into account the resilience dynamic within the ES score. The method first needed to be modified in order to include the physicochemical history of the sampled site. Thus, three new RSSI-based ES scores were created. Three main steps were required to reach this objective: 1) Normalize the RSSI score by its reference soil, disturbed or not; 2) Determine the most Zn-sensitive ES score by correlating the ES scores (new and old) to the soil Zn concentrations and; 3) Perform a multivariate analysis in order to verify which soil physicochemical properties affect the ES. The results related to this objective are shown in chapter 4. The best ES score obtained is one of the new scores which include the physicochemical history of the sampled site, i.e. the RSSIb score. This score detected the Zn toxicity on three individual enzymes (arylsulfatase, protease and urease) whereas other ES scores detected the Zn toxicity for only one enzyme, which varied depending on the score. The labile Zn concentration generated the highest R2, although the soluble Zn concentration was also well correlated to the RSSIb. The total Zn concentration was a poor predictor of Zn toxicity. The statistical results also showed that texture and pH were moderately correlated to the RSSIb, whereas other properties (total and dissolved organic carbon, cationic exchange capacity and buffer capacity) poorly affected the RSSIb score. The ES assessment by the RSSIb score is a suitable ecotoxicological indicator of Zn in contaminated field soil, since this score almost solely depends on the bioavailable Zn fraction of soils. ENZYMATIC FUNCTIONAL DIVERSITY INDEX  The third specific objective was to develop a Zn-sensitive enzymatic functional diversity index and led to the third manuscript (chapter 5) submitted in the Soil Biology & Biochemistry journal. Alongside this objective, the most Zn-sensitive and judicious practical enzymatic approach between traditional activity or stability needed to be elucidate. Four steps were required to reach this objective: 1) Develop a statistically valid functional diversity index based on the aggregated enzymatic results (activity and stability); 2) Calculate the selected FD indexes for every Zn-contaminated field soil and every enzymatic approach; 3) Correlate these FD indexes with the Zn concentrations in order to generate ecotoxicological data and; 4) Compare the regression parameters and identify the most relevant enzymatic approach. The enzymatic aggregation was statistically validated by a principal component analysis showing that at least 75% of the enzymatic variability could be explained by the main component, which justified the aggregation of the 6 variables (enzymatic responses) in one FD index. Many FD indexes were tested, but the weighted and geometric means better assessed the Zn toxicity than other indexes such as the Shannon, Simpson or Gini index. The enzymatic FD indexes based on means were similarly sensitive to soluble and labile Zn concentrations, but not to the total Zn concentration. Moreover, the traditional enzymatic activity approach remained as Zn-sensitive as the enzymatic stability approach even after many years of metal exposition. This entails that, although the idea of using the ES approach was thoughtful and judicious, this approach did not provide any added value for the Zn toxicity assessment by aggregated enzymatic results. CONCLUSION Globally, this thesis defines the basis of a new in situ methodology for the long-term terrestrial ecotoxicity of Zn, based on the enzymatic functional diversity, an increasingly promoted attribute of ecological relevance. This methodology could be used for other metals in order to generate more ecotoxicological data and ultimately improve the potential ecotoxic impact modeling of metals in LCA.