identifier: Côté, Jean-François  (1996). Étude biochimique de la nosynthaseneuronaledechatetderat.  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en sciences expérimentales de la santé, 112 p.

abstract:
La transcription des symboles et des caractères spéciaux utilisés dans la version originale de ce résumé n’a pas été possible en raison de limitations techniques. La version correcte de ce résumé peut être lue en PDF. Des cellules et des tissus tels que les cellules endothéliales, les neutrophiles, les
neurones et les surrénales ont la capacité d'oxyder la L-arginine en engendrant la formation
d'oxyde nitrique (NO) et de citrulline, conune produits. Une telle conversion est générée par
la NO synthase (NOS), une enzyme cytoplasnüque. Le NO ainsi produit est un messager
cellulaire agissant comme activateur de la guanylyl cyclase. L'objectif des présents travaux est d'étudier biochimiquement la NOS neuronale de
chat en s'attardant à : 1) l'effet des cofacteurs (calcium, calmoduline, FAD et
tétrahydrobioptérine) sur l'activité enzymatique, 2) la détermination des paramètres cinétiques
pour le substrat arginine et 3) la détermination de la constante d'inhibition d'inhibiteurs de la
NOS. Un autre objectif est d'étudier la distribution régionale de l'activité spécifique de la
NOS dans onze structures neuroanatomiques du cerveau de chat. Les mêmes études seront
effectuées dans le cerveau de rat avec le but de faire un comparaison interespèces de la même
enzyme. Un dernier objectif est de faire une caractérisation préliminaire du fonctionnement
de la NOS des glandes surrénales et du foie. L'activité de la NOS est déterminée en mesurant
la formation de [3H] citrulline à partir de [3H]-arginine dans un milieu d'incubation conte~t
une NOS semi-purifiée. Les travaux montrent que dans le cerveau de chat ainsi que dans celui de rat, l'activité
de la NOS neuronale est : 1) dépendante de la présence de NADPH, 2) dépendante du tandem
calcium/calmoduline, 3) significativement activée par un ajout de FAD et de
tétrahydrobioptérine (chez le chat, le V-. passe de 59.4 à 118 pmol de citrullin/mg prot/min et chez le rat il passe de 149 à 185 pmol de citrulline/mg prot/min), 4) présente à différents
niveaux dans les onze structures du cerveau de chat et les cinq structures du cerveau de rat
étudiées montrant que la NOS est largement distribuée dans le système nerveux de ces deux
espèces. De plus, le Km pour l'arginine chez le chat est de 11 uM en présence de FAD et de
tétrahydrobioptérine et de 41 uM lorsque ces cofacteurs ne sont pas ajoutés. Ces résultats
montrent qu'en présence de FAD et de tétrahydrobioptérine dans le milieu d'incubation, les
interactions enzyme-substrat sont stabilisées. Des résultats allant dans la même direction ont
été obtenus chez le rat (un Km de 4.8 uM en présence de FAD et tétrahydrobioptérine et de
19.3 uM lorsque les cofacteurs ne sont pas ajoutés). Les présents travaux montrent aussi que l'activité de la NOS des surrénales est :
dépendante du tandem calciurnlcalmoduline, dépendante de la présence de NAD PH, activée
par la présence de FAD et de tétrahydrobioptérine et réduite par des inhibiteurs compétitifs
de la NOS. La cinétique de l'enzyme face à l'arginine a révélé un v_ de 84 pmol de
citrulline formée/mg prot/min et un Km de 28 J1M. Ces résultats montrent des propriétés de
la NOS surrénalienne très ·similaires à la NOS neuronale. Finalement, le foie de rat ne
démontre aucune activité constitutive de NOS.


identifier: Vincent, Patrick  (1996). Clonage, purification et caractérisation d'une nouvelle α-L-arabinofuranosidase chez Streptomyces lividans.  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 115 p.

type:
Thèse
Non évalué par les pairs

abstract:
L'arabinose est un sucre constitutif des plantes et est retrouvé comme groupement
dans plusieurs hémicelluloses dont les arabinoxylans de céréales, mais peu dans les xylans
des bois mous ou des bois durs. L'α-L-arabinofuranosidase catalyse l'hydrolyse d'un lien
0-glycosidique d'un groupement α-L-arabinofuranosyl des arabinoxylans, des arabinans,
des arabinogalactans, ainsi que des arabino-oligoxylosides. Une α-L-arabinofuranosidase (AbtB) a été purifiée chez Streptomyces lividans, avec
une masse moléculaire de 43 000 Da et un point isoélectrique de 7 ,4. L' AbfB a libéré
l'arabinose comme unique produit d'hydrolyse sur des substrats de haut poids moléculaire
tel l'arabinoxylan et également les arabino-oligoxylosides de faible poids moléculaire, mais
non sur les substrats synthétiques tel le p-nitrophényl-α -L-arabinofuranoside ou le 4
méthylumbélliféryl-α-L-arabinofuranoside. La présence d'un site de fixation sur le xylan
(XBD) a montré que cette enzyme a eu une affinité envers les B-1,4-xylans. L'enzyme
a possédé une activité B-xylosidasique résiduelle sur les arabino-oligoxylosides de faible
poids moléculaire. L' AbfB a été une enzyme synergique dont l'activité a augmenté
1'activité des xylanases sur les arabinoxylans. Finalement, l'AbfB a eu des caractéristiques
biochimiques et une spécificité de substrat très différentes de 1'AbfA de S. lividans.


identifier: Beaudoin, Jean  (1996). Étude de la dégradation de contaminants provenant d'un effluent de pâte à papier par fermentation méthanique et par irradiation gamma.  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 138 p.

abstract:
Ce projet de recherche porte sur la dégradation de composés organochlorés
polluants (AOX) que l'on retrouve dans un effluent du procédé de blanchiment au
chlore d'une usine de pâtes et papiers. Ces composés organochlorés se divisent en deux
catégories, soit ceux de faibles poids moléculaires, telle 3,4,5-trichlorocatéchol, et ceux
de hauts poids moléculaires, comme les chlorolignines. Ce projet de recherche consiste
à faire la comparaison de la dégradation de ces deux types de composés dans un effluent
réel à l'aide de deux procédés distincts, à savoir la fermentation méthanique et
l'irradiation gamma afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la
dégradation. D'autres paramètres comme la DCO et la toxicité (Microtox) ont été
mesurés. De plus, des essais en séquences ont été effectués pour vérifier si l'irradiation
rend les composés organiques présents dans l'effluent plus accessibles pour les
microorganismes anaérobies. Un système de réacteur anaérobie à film fixe a donc été développé à partir d'un
consortium bactérien dégradant le PCP pour traiter les chlorocatéchols. L'effluent a
aussi été traité par irradiation gamma comme modèle de radiations ionisantes pour
mimer l'action d'un canon à électrons. Pour mieux suivre la dégradation des
chlorocatéchols, l'effluent a été fortifié avec du tétrachlorocatéchol (5 ppm). La voie de
dégradation des chlorocatéchols a été déterminée pour les deux traitements. Ces études démontrent une similitude entre les deux voies de dégradation. Une réduction de 52%
de la DCO a été obtenue, de même qu'une disparition de 58% des chlorocatéchols dans
l'effluent fortifié pour un temps de rétention hydraulique de 2,3 jours dans un réacteur
anaérobie. Avec une dose 30 kGy, une dégradation de plus 99% des chlorocatéchols a
été observée. Une dose de 40 kGy élimine plus de 70 %des AOX présents dans
1 'effluent. Ces études ont de plus démontré que r irradiation gamma n'a que peu d'effet
sur la réduction de la DCO et que même si l'irradiation est reconnue pour réduire la
taille des molécules de hauts poids moléculaires, elle n'a pas rendu la matière organique
de l'effluent plus accessible aux microorganismes anaérobies.


identifier: Merzouki, Abderrazzak  (1996). Relation entre l'activité de la cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps (ADCC) et la diversité génétique virale: cohorte croisée de patients à différents stades de l'infection au VIH-1  Thèse.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en virologie et immunologie, 267 p.

abstract:
La variabilité génétique du gène env du VIH-1, et en particulier celle de la région
V3, est directement impliquée dans le contrôle du phénotype viral. Le domaine V3 est en
fait impliqué dans le contrôle de nombreuses propriétés biologiques du virus, incluant le
tropisme cellulaire, l'infectivité et la cytopathogénicité. Certains changements d'acides
aminés au niveau du domaine V3 ont été associés à l'émergence de souches de virus
inductrices de syncitia qui sont en corrélation avec le déclin rapide des cellules CD4+ et la
progression de la maladie. En plus, cene région renferme des déterminants antigéniques
majeurs pour la réponse immunitaire humorale et cellulaire, dont la cytotoxicité cellulaire
dépendante des anticorps (ADCC). L'ADCC est une composante importante de la réponse immunitaire qui, durant
l'infection au VIH-1, aide à éliminer les cellules infectées autologues et allogéniques.
Cependant, le niveau d'implication de I'ADCC dans le maintien de l'état asymptomatique et
son rôle à différents stades de l'infection sont encore mal définis, d'où notre travail dont le
but était d'évaluer, dans un premier temps, le niveau de l'activité ADCC (titres d'anticorps
ADCC) chez 33 patients à différents stades de l'infection au VIH-1. Ensuite, étudier la
diversité génétique des quasi-espèces provirales présentes chez ces mêmes patients afin
d'établir, dans un deuxième temps, une corrélation (si corrélation existe) entre la diversité
génétique virale et l'activité ADCC à différents stades de l'infection. L'approche expérimentale consistait en l'établissement de cellules exprimant à leur
surface, de façon stable, les glycoprotéines de l'enveloppe du VIH-1 NL4.3 dont l'intégrité
structurale et fonctionnelle sont intactes. Ces cellules, en plus de garder leur résistance à la
lyse spontanée par les cellules NK (PBMC) (p>O,O5), comparées à la lyse des cellules
CEM.NKR, montraient une susceptibilité significative (p≤O,O5) à la lyse par le
mécanisme ADCC en présence de sérum anti-VIH-1 de donneurs séropositifs, en
comparaison avec la lyse en présence de sérum normal de donneurs séronégatifs. L'utilisation de ces cellules pour déterminer les titres d'anticorps AOCC dans les
sérums de patients à différents stades de l'infection (étude croisée) a permis de montrer une
altération profonde des titres d' anticorps ADCC et de l'activité ADCC avec la progression
de l'infection. La moyenne des niveaux ADCC (en pourcentage de lyse spécifique) dirigés
par les sérums de patients, a chuté de 25, 7±11,5% au stade TI de l'infection, à
10,3±8,5% au stade III et à 6,4±8,5% au stade IV. Au niveau des titres d'anticorps ADCC, 82% (9/11) des sérums de patients au stade II de l'infection présentaient des titres
supérieurs à 104 comparativement à 30% (3110) au stade rn et 25% (3/12) au stade IV. La chute des titres d'anticorps ADCC qui coïncidait avec la chute du nombre de
cellules CD4 (799±267 au stade II de l'infection, 515±236 au stade III et 37 ,25±44 au
stade IV) ne semble pas, par contre, en relation directe avec la diversité génétique arborée
par la population des quasi-espèces provirales isolées à partir des cellules de ces mêmes
patients. En effet, l'étude de la diversité génétique des régions de l'enveloppe renfermant
les épitopes ADCC (boucle V3, domaine de fixation de la gp120 au récepteur CD4, et la
région immunodominante de la gp41) a montré une variabilité génétique intrapatient et
interpatients comparable, et ce indépendamment du stade de l'infection. La diversité
génétique intra·Jinter-patient au niveau de la boucle V3 était de l'ordre de 6,1 ±3,9%
(de 0 à 15,2%)/ 12,2±2,1% (de 9,1 à 15,7) chez les individus au stade II de
l'infection, par rapport à 6,4±1,7% (de 2,9 à 9,0)/12,5±2,0 (de 10,0 à 16,0) au
stade III et 8,8±4,7% (de 2,9 à 19,0)/12,4±2,0 (10,9±17,3) au stade IV. Pour
les régions C4 et C5, la diversité génétique intrapatient, très similaire, n'a jamais dépassé
4% (de 1,8 à 4,0), et ce, peu importe le stade de l'infection, alors que la diversité
interpatient variait entre 5,3 à 8,6%. Cependant, l'absence de corrélation entre le taux de variabilité génétique et l'activité
ADCC (titres d'anticorps ADCC) n'exclue pas l'émergence de quasi-espèces ayant dirigé
des mutations spécifiques, en réponse à la pression sélective exercée par le système
immunitaire, qui pourraient leur conférer une meilleure adaptation à 1' environnement
immunitaire hôte. Ces formes adaptées de quasi-espèces peuvent causer plus de dommages
au système immunitaire. Cet énoncé est supporté d'une part, par des taux de substitutions
non-synonymes élevés au niveau de la boucle V3, renfermant plusieurs domaines
fonctionnels, comparativement aux régions C4 et C5 dont les séquences montraient des
taux de substitutions non-synonymes très bas. D'autres part, par l'apparition, chez 58%
des patients, de quasi-espèces dont les séquences prédisaient un phénotype inducteur de
syncitia, connues pour leur adaptation optimale à l'environnement immunitaire hôte et pour
leur vitesse de réplication et leur cytopathogénicité élevée. L'étude de la réplication virale à l'intérieur des cellules, en utilisant la technique de
RT-qc-PCR pour la quantification des ARNm viraux a montré qu'en moyenne le ratio
d'épissage (ratio ARNm régulateurs:ARNm structuraux) était 2,3 fois supérieur chez les
patients au stade rn et IV comparativement à celui observé chez les patients au stade II de
l'infection. Ces ratio, qui témoignent d'une plus grande production de virions durant les stades avancés de l'infection coïncident avec la chute de l'activité ADCC (chute des titres
d'anticorps ADCC) et la dépletion des cellules CD4. Cette étude n'a cependant pas pennis
d'établir une relation directe entre la cinétique de réplication des souches virales, leur
diversité génétique et la chute des titres des anticorps ADCC. En effet, plusieurs patients,
dont l'activité ADCC semblait intacte, montraient des ratio d'épissage comparables à ceux
de patients dont l'activité ADCC était lourdement altérée. Par contre, les résultats de
quantification des ARNm viraux nous ont confirmé un des faits les plus importants dans la
pathogenèse associée à l'infection au VIH-1, à savoir que la réplication du virus est active
et ce même durant la phase dite "quiescente" de l'infection (stade asymptomatique). En conclusion, la diversité génétique du VIH-1 ne semble être ni la cause directe ni
la conséquence de la perte de l'activité ADCC (chute des titres d'anticorps ADCC). En fait,
la réponse immunitaire, avec l'ADCC en tête, semble bien s'adapter à la présence de
souches de virus divergents et en particulier durant le stade asymptomatique de l'infection.
Ainsi, nous croyons que la réponse ADCC, probablement comme la réponse CTL, est
requise pour éliminer les cellules infectées et aider à maintenir la charge virale aussi basse
que possible ainsi que l'état asymptomatique. La progression vers le SIDA pourrait être
précipitée suite à des perturbations graduelles de l'immunité cellulaire après la chute du
nombre de cellules-T CD4+ et suite à l'altération de la fonction des cellules T. Dans notre
étude croisée, la chute des cellules-T CD4+ ne semble pas corréler avec la diversité
génétique virale. L'ensemble de ces résultats soulève de nouvelles questions, mais en particulier
celles visant à comprendre les événements capables de perturber une infection au VIH-1
dans un état asymptomatique stable.


identifier: Lirette, Patricia  (1996). Optimisation de la biodégradation des hydrocarbures aromatiques polycycliques.  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 189 p.

abstract:
Suite à la caractérisation chimique et microbiologique du
sol de la Sablière Thouin, la microflore indigène a été
récupérée suivant une première méthode pour être ensuite
inoculée en milieu liquide BH en présence des quatre HAPs
fluorène, phénanthrène, pyrène et chrysène à raison de lOO mg/L
chacun. Des pourcentages d'enlèvement significatifs ont été
obtenus sous ces conditions pour les HAPs légers fluorène (85%)
et phénanthrène (90%) après 16 jours d'incubation, mais aucun
enlèvement significatif des HAPs lourds (pyrène et chrysène)
n'a été obtenu. Le milieu liquide BH supplémenté d'extrait de
levures à 0.5% (p/v) a permis d'obtenir un enlèvement plus
rapide du fluorène et du phénanthrène. Le suivi de la
population bactérienne totale a été effectué sur ces cultures
et a démontré une population plus élevée lorsque le milieu BH
était supplémenté d'extrait de levures (109 à comparer à 107
UFC/mL) qu'en milieu BH. Des résultats semblables ont été
obtenus pour la population bactérienne dégradant
potentiellement le phénanthrène. De plus, la concentration
d'extrait de levures a pu être réduite à des valeurs en-dessous
de 0.5% (p/v), à condition que du surfactant Tween {200 ppm) ou
un mélange d'alcanes (300 ppm) soit ajouté au milieu. L'ajout
de lisier de porc a permis d'obtenir des résultats comparables à ceux obtenus avec l'ajout d'extrait de levures. Une modification de la méthode de récupération des
microorganismes a été effectuée, de sorte à obtenir un inoculum
plus important et plus représentatif. Cette modification a
permis l'enlèvement d'un HAP lourd, soit le pyrène. Des
résultats semblables ont été obtenus avec l'inoculation d'une
plus forte concentration de bactéries indigènes, soit 106
UFC/mL. Une souche bactérienne indigène du sol a été isolée à
partir d'une culture liquide en milieu BH et a démontré la
capacité de former un halo etjou une coloration typique de la
présence d'intermédiaires en présence de plusieurs HAPs soit le
fluorène, le phénanthrène, le pyrène, l'acénaphtylène, le
dibenzofurane, le dibenzothiophène, l'anthracène, le
fluoranthène, le biphényl, le naphtalène et le benzanthracène.
Son activité d'enlèvement du fluorène et du phénanthrène a été
confirmé en milieu liquide BH avec ces HAPs comme seule source
de carbones. Par contre, 1' inoculation de cette souche en
microcosmes n'a pas permis d'optimiser l'enlèvement des HAPs. La recherche d'intermédiaires de dégradation du fluorène
et du phénanthrène a été effectuée en milieu liquide BH
supplémenté de 0.5% (p/v) d'extrait de levures et inoculés avec la microflore indigène. Cependant, aucun
intermédiaire
potentiel n'a été identifié suite à ces expériences. En microcosmes, la microflore indigène du sol est capable
de dégrader presqu'entièrement le fluorène et le phénanthrène,
après 30 jours d'incubation avec une agitation quotidienne à
300 rpm pendant 5 minutes. Sous ces conditions, le pyrène et le
chrysène ont été enlevés à 60 et 33%, respectivement, après 60
jours d'incubation. Une augmentation du pourcentage
d'enlèvement des quatre HAPs a été observée en microcosmes
contenant le milieu BH et agités quatre fois par jours à 300
rpm pendant 5 minutes. Cependant, l'ajout d'extrait de levures à 0.5% (pjv) au
milieu BH en microcosmes a ralenti, voir même complètement
inhibé, l'enlèvement du fluorène, du pyrène et du chrysène. De
plus, ce ralentissement a été proportionnel à la concentration
d'extrait de levures ajoutée. Toutefois, l'extrait de levures
n'a pas influencé l'enlèvement du phénanthrène de façon
significative. L'ajout de lisier de porc (1% (vjv)), de Tween
80 (200 ppm) ou de salicylate (100 ppm), n'a pas permis
d'optimiser l'enlèvement des HAPs en microcosmes. Le remplacement du milieu BH par de l'eau distillée dans
un sol avec le rapport C: N ajusté à 1 o o: 10, a permis de démontrer que les éléments présents dans ce milieu ne sont pas
essentiels pour l'enlèvement du fluorène et du phénanthrène,
mais qu'ils le sont pour l'enlèvement du pyrène et du chrysène.
La réduction du volume de milieu BH (double concentration) à 12
mL au lieu de 27 mL a conduit à l'inhibition quasi complète de
l'enlèvement des quatre HAPs à l'étude. Le suivi de la population bactérienne totale et de celle
dégradant potentiellement le phénanthrène en microcosmes
contenant le milieu BH supplémenté de 0.5% (p/v) d'extrait de
levures, a été effectué. Les résultats obtenus, après 30 jours
d'incubation, indiquent une augmentation de la population
totale de 105 à 107 UFC/g, en plus d'un enrichissement de la
population dégradant le phénanthrène, qui est passée de 19 à
40% de la population totale. Des microcosmes ont été incubés en présence des HAPs
fluorène, phénanthrène ou pyrène, marqués radioactivement au
carbone 14. Ces expériences ont permis de démontrer une
minéralisation de ces HAPs jusqu'au co2, après 30 ou 60 jours
d'incubation. Toutefois, cette minéralisation a été beaucoup
moins intense pour le pyrène.


identifier: Dubuc, Roger  (1996). Mise au point et contrôle de la qualité de la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) appliquée au diagnostic de parvovirus porcins (PPV)  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 267 p.

abstract:
Ce projet de maîtrise visait deux objectifs principaux. Premièrement, doter le
Service de diagnostic virologique vétérinaire de l'Institut Armand-Frappier,
subventionné par le Ministère de l'Agriculture, Pêcheries et Alimentation du Québec
(MAP AQ), d'une méthode d'analyse permettant de distinguer les souches pathogènes
(virulentes) et non pathogènes (vaccinales) de parvovirus porcin (PPV). L'approche
envisagée était basée sur la biologie moléculaire du virus et impliquait l'utilisation de
la réaction de polymérisation en chaîne (PCR). Cette utilisation de la PCR comme
instrument de diagnostic établissait le deuxième objectif de la recherche: évaluer les
possibilités et les limites de cette nouvelle technologie en fonction du Service et surtout,
définir une stratégie pouvant en assurer le contrôle de qualité. Mettant à profit l'identification des déterminants allotropiques de différentes
souches de PPV (Bergeron et al., 1996), nous avons développé une méthode de PCR
discriminant les souches pathogènes et non pathogènes de ce virus. Dans cette optique,
deux paires d'amorces sont utilisées à l'intérieur d'un même cocktail d'amplification; de
telle sorte qu'alternativement deux amplicons de longueurs différentes (révélateurs de
la souche de PPV) de même qu'un amplicon commun (indicatif de la présence de PP V)
sont générés. Dans chaque combinaison, une seule des deux amorces est spécifique à
la souche, et ce, grâce aux deux derniers nucléotides utilisés en 3'. De cette manière,
nous avons entre autre identifié de façon non équivoque un PPV de type virulent isolé
de l'intestin d'un porc diarrhéique. Durant la mise au point de cette technique, nous avons rencontré des problèmes
de reproductibilité de la PCR, ce qui nous a amené à entreprendre une étude de stabilité
de l'ADN plasmidique de même qu'à tenter de cerner le rôle d'éventuels inhibiteurs de
la réaction de polymérisation en chaîne. Quoique difficilement identifiables, ces
inhibiteurs ont pu être transférés d'un tube à l'autre. À l'inverse, nous avons aussi
rencontré des problèmes de contamination moléculaire générant de faux résultats
positifs en PCR. Afin détablir une philosophie de contrôle de qualité, nous avons privilégié une
approche quantitative de la PCR. Nous avons mis au point une réaction de PCR
classique où l'amplicon de PPV généré contient naturellement un site de restriction
EcoRI. À partir d'un plasmide contenant le génome entier et infectieux du PPVNADL2
(Bergeron etal., 1993), nous avons, par mutagénèse dirigée, créé un génome
PPV mutant où le site Eco RI est transformé en site de restriction BamHI. Ce gabarit
sert de standard interne dans la réaction de PCR classique et une seule paire d'amorces
amplifie indistinctement et avec la même efficacité les PPV sauvage et mutant. Une des amorces étant biotinylée en 5', il devient possible de capturer les
amplicons sur une micro-plaque enrobée de streptavidine. Après dénaturation alcaline,
les ADN monocaténaires capturés sont hybridés, en aval du site de restriction, à une
courte sonde dont l'extrémité 3' est marquée à la digoxigénine. Chaque échantillon occupe au moins trois cupules. La première cupule, intacte, n'est pas soumise aux
enzymes de restriction et représente la quantité totale d'amplicons. Les deuxième et
troisième cupules sont respectivement soumises à la digestion enzymatique de Eco RI
et de Bamffi. La coupure EcoRI élimine le signal généré par le PPV sauvage, mais
n'affecte pas celui du standard interne. La coupure Bamlll élimine le signal généré par
le standard interne, mais n'affecte pas celui du PPV sauvage. Subséquemment à la digestion enzymatique, un anticorps anti-Dig, conjugué à
la peroxydase, sert de révélateur par son action sur le substrat (TMB:H20 2) et la
coloration produite est lue au spectrophotomètre. De cette façon, la performance
globale du système est évaluée grâce à la somme des absorbances, obtenues avec les
cupules soumises aux enzymes de restriction, qui doit égaler l'absorbance de la cupule
intacte. De plus, un signal absent ou trop faible de la part du standard interne permet
d'éliminer les éventuels faux négatifs. L'ajout d'échantillons ne contenant pas d'ADN
sert de contrôle pour les faux positifs. Les essais préliminaires ayant porté sur des constructions de laboratoire, nous
nous sommes ensuite tournés vers les échantillons cliniques. Une centaine de cas, la
plupart étant des foetus de porc déjà analysés selon les méthodes conventionnelles de
diagnostic vétérinaire, a servi de matériel de base. Plusieurs méthodes d'extraction du
PPV ont été essayées. Finalement, une procédure utilisant la protéinase K additionnée directement au tampon de PCR a été retenue. Nous avons également tenté de
transfecter des cellules eucaryotes avec l'ADN plasmidique du PPV mutant et
théoriquement infectieux. Cette démarche visait à générer un véritable virus modifié
pouvant servir non seulement de standard interne en PCR, mais aussi de contrôle
d'efficacité de l'extraction du PPV des échantillons cliniques. Malheureusement, toutes
les tentatives sont demeurées vaines. Sur 119 cas analysés par PCR différentielle, sept ont été trouvés positifs au PPV;
exactement comme l'isolement par passages sur cultures cellulaires, mais nettement
moins que l'immunofluorescence sur coupes de tissus qui déclarait 56% des échantillons
infectés de PPV. Les sept cas positifs présentaient tous un profil de PPV pathogène.
L'analyse d'une trentaine de spécimens par PCR quantitative s'est révélée beaucoup plus
problématique. La présence occasionnelle d'hétéroduplex, mais surtout un manque de
cohérence au niveau des digestions enzymatiques, exigeraient une poursuite de la
recherche.


identifier: Ochietti, Benoit  (1996). Clonage et expression du gène de la protéase du VIH-1 dans un système bactérien.  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 141 p.

abstract:
La protéase joue un rôle primordial dans la maturation du virus de
l'immunodéficience humaine, l'agent étiologique du SIDA. Cette enzyme est impliquée
dans le clivage protéolytique des précurseurs polyprotéiques exprimés des gènes
GAG et POL du VIH. L'inhibition de la protéase aboutirait à la formation de virions
immatures non infectieux, donc incapables de compléter un nouveau cycle réplicatif.
Depuis quelques années, notre laboratoire a développé une expertise dans la
synthèse d'inhibiteurs spécifiques à la protéase du VIH-1 . De plus, le laboratoire
s'intéresse également à l'étude des interactions protéase-inhibiteur par RMN. Cette
technique nécessite d'importantes quantités de l'enzyme. Ces études portent
également sur des fragments de la protéase. Bien que la protéase du VIH soit
disponible commercialement, son coût très élevé justifie la mise au point d'un
protocole de production et de purification efficace. De plus, les fragments de l'enzyme
ne sont pas disponibles commercialement. Le vecteur bactérien pET-16b de la compagnie Novagen a été utilisé pour
l'expression de la protéase du VIH-1 sous forme de précurseurs polyprotéiques. Le
gène de la protéase obtenu du NIH a d'abord été modifié par RPC puis sous-cloné
dans le vecteur de propagation p T7T3a 18 et enfin dans le vecteur pET -16b. La forme
précurseur comporte une queue d'histidine en position N-terminale permettant sa
purification en une seule étape par chromatographie par chélation métallique. L'enzyme a également été purifiée par filtration sur gel Séphadex G-75. Une des protéases exprimées possède un site d'autoclivage en position Nterminale
éliminant la queue d'histidine. L'enzyme sous cette forme a été purifiée par
chromatographie d'affinité sur colonne pepstatine A-agarose. Ces différentes
méthodes ont permis l'obtention de protéases partiellement purifiées. Par contre, les
constructions pour les deux fragments de la protéase seront à préparer de nouveau
à cause de problèmes avec les amorces utilisées pour l'amplification des séquences
correspondantes. Ce projet de recherche met en évidence l'efficacité de la technique de RPC
combinée au clonage dans un vecteur multifonctionnel de type pT7T3a18. Par
ailleurs, nos résultats soulignent les difficultés reliées à l'expression et à la purification
d'une protéine toxique dans un système bactérien, et montrent l'importance du choix
du vecteur d'expression et de la souche bactérienne dans de telles conditions.


identifier: Déziel, Éric  (1996). Étude de la production de biosurfactants par des souches bactériennes métabolisant les hydrocarbures aromatiques polycycliques.  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 263 p.

abstract:
Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des polluants organiques
largement distribués dans l'environnement. Ils représentent un risque élevé pour la santé et il est
donc nécessaire de restaurer les nombreux sites contaminés. Les technologies de traitements
biologiques utilisant le potentiel des micro-organismes à dégrader une grande variété de
substances organiques présentent plusieurs avantages sur les technologies physico-chimiques
traditionnelles. Cependant, la restauration d'un site contaminé par des HAP est limitée par la faible
biodisponibilité de ces polluants hydrophobes et non-polaires. l'addition de surfactants permettrait
d'augmenter la solubilisation, la mobilisation et possiblement la biodégradation des polluants.
Cependant, les surfactants synthétiques possèdent plusieurs désavantages qui rendent leur
utilisation problématique. les surfactants produits par des micro-organismes pourraient alors
constituer une alternative nouvelle et intéressante. Le but de ce projet consistait à isoler des micro-organismes dégradant des HAP et à
détenniner s'ils pouvaient produire des biosurfactants en utilisant des HAP comme substrat. Pour
ce faire, des bactéries isolés de sols contaminés par des hydrocarbures ont premièrement été
criblés pour leur capacité à former des zones d'éclaircissement sur des géloses recouvertes d'un
mince film de HAP pulvérisés. Des 84 souches bactériennes obtenues de la Sablière Thouin, un
site ayant reçu des quantités importantes de résidus pétroliers au cours des années '60, 34
dégradaient ou transformaient au moins un HAP. l'étude du profil catabolique de ces souches
nous a permis de déterminer que 23 d'entre elles, identifiées comme des Pseudomonas
fluorescents, pouvaient croître avec un HAP de deux ou trois cycles aromatiques comme seul
substrat. Elles pouvaient également transformer l'indole en indigo, une indication de la présence
d'une activité de la naphtalène dioxygénase. L'addition de salicylate n'induisait la biodégradation
des HAP que chez les souches de Ps. aeruginosa. Aucune des bactéries isolées de la Sablière
Thouin n'ont pu dégrader les HAP comportant plus de trois anneaux aromatiques. Afin d'isoler des
micro-organismes pouvant dégrader des HAP de plus haut poids moléculaire, des bactéries provenant d'un sol prélevé à la base de poteaux de bois traités à la créosote ont été criblés selon
la méthode par pulvérisation. Des isolats bactériens obtenus, deux souches identifiées comme des
Sphingomonas sp. ont démontré la capacité de dégrader le nuoranthène. le pyrène et le
benz(a)anthracène, des HAP de quatre cycles aromatiques. Ces deux Sphingomonas cultivées
avec le dextrose ou une mixture de HAP produisaient un bioémulsifiant, mais pas de biosurfactant. Panni les 23 souches de Thou in capables de croître sur les HAP, les neuf Ps. aeruginosa
et un Ps. putida pouvaient produire des biosurfactants en utilisant des substrats solubles comme le
dextrose et le mannitol, ou un HAP comme le naphtalène. Nos observations suggèrent qu'il s'agit
de rhamnolipides, le biosurfactant anionique habituellement sécrété par Ps. aeruginosa. Un milieu
de culture pauvre en fer favorisait la production de biosurfactants. Nous avons observé qu'une
activité émulsifiante, possiblement indépendante des rhamnolipides, se manifestait lors des
cultures effectuées pour la production de biosurfactants. L'étude détaillée de la croissance et de la
production de biosurfactants à partir du naphtalène a également pennis de constater que
l'hydrophobicité de la paroi cellulaire variait dans le temps. Des micro-organismes croissant sur les hydrocarbures aliphatiques sécrètent des
biosurfactants et des bioémulsifiants, ce qui facilite l'utilisation des substrats hydrophobes.
Cependant, l'isolement de bactéries produisant des biosurfactants lors de la croissance sur des
HAP représente un aspect nouveau par rapport aux travaux déjà publiés. Une meilleure
compréhension des mécanismes microbiens responsables de la dégradation des HAP étant
essentielle à l'amélioration des bi-traitements, les résultats obtenus contribuent à faire avancer les
connaissances dans le domaine.


identifier: Demers, François  (1996). Rôle du VIH dans le processus d'engagement vers une mort cellulaire par apoptose des lymphocytes T auxiliaires.  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 216 p.

abstract:
La baisse fonctionnelle et numérique des lymphocytes T CD4+ sont les
événements qui caractérisent le mieux la progression de l'infection par le virus
de l'immunodéficience humaine (VIH). Les lymphocytes T CD4+ étant les
cellules-clés de la réponse immunitaire, leur déplétion se traduit par une perte
graduelle de l'efficacité du système immunitaire. L'immunodéficience ainsi
causée par le VIH se manifeste tardivement par le développement d'infections
opportunistes et de certaines néoplasies. L'absence d'un traitement curatif fait
que l'issue du syndrome de l'immunodéficience acquise (SIDA) est toujours
fatale. Plus d'une douzaine d'années après l'identification de l'agent
étiologique du syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) par le Pr. Luc
Montagnier et ses collègues (Barré-Sinoussi et al., 1983), la nature des
mécanismes par lesquels le virus entraîne le SIDA reste encore mal comprise.
La déplétion progressive, puis la disparition complète de la population de
lymphocytes T CD4+ ne peuvent s'expliquer uniquement par l'infection de ces
cellules par le VIH. En effet, il a été démontré que le virus n'infecte qu'un
faible pourcentage des lymphocytes CD4+ (Bagasra et al., 1992). Différents
mécanismes indirects ont donc dûs être considérés. Certains chercheurs ont
émis l'hypothèse qu'une réémergence inappropriée d'une mort cellulaire
programmée, ou apoptose, induite par le VIH pourrait expliquer la baisse
fonctionnelle et la diminution graduelle du nombre de lymphocytes T CD4+
dans le sang (Montagnier et al., 1991; Gougeon et al., 1991; Ameison et Capron,
1991). Dans notre projet, nous avons voulu déterminer la capacité du VIH et
plus spécifiquement, de la glycoprotéine de son enveloppe, la gp160, à induire
en apoptose des cellules provenant d'une lignée cellulaire lymphoblastoïde
CD4+. En utilisant différentes conditions expérimentales, nous avons trouvé
que ni le VIH, ni les Immunosomes-gp160, qui sont des vésicules
phospholipidiques sur lesquels la gp160 est ancrée, n'induisent les cellules T
CD4+ en apoptose. Par contre, la glycoprotéine virale purifiée et agencée en
rosette, a induit en apoptose 30% d'une population de lymphocytes T CD4+, en
seulement 6 heures d'incubation. Dans une autre expérience, une
préincubation de la gp160 avec des anticorps anti-gp160 a annulé l'induction
d 'apoptose. Ce dernier résultat démontre que la gp160 agit de manière
spécifique comme une inductrice de l'apoptose. Par ailleurs, d'autres résultats que nous avons obtenus montrent qu'un
ou plusieurs facteurs présents dans le sérum foetal bovin (SFB) ainsi que dans
le sérum humain protègent les cellules de l'action de la gp160. Il semble
également que les sérums d'individus séropositifs offrent une moins bonne
protection contre l'apoptose induite par la gp160 que les sérums provenant de
personnes séronégatives. Nos résultats suggèrent donc que la gp160 libre se trouvant dans les
ganglions et le sang, pourrait induire une proportion significative de
lymphocytes T CD4+ en apoptose. De plus, la gp160 semble bénéficier de
conditions favorables à son action puisque le sérum provenant de personnes
séropositives semble offrir une moins bonne protection qu'un sérum normal
contre l'apoptose induite par la gp160.


identifier: Canuel, Lucie  (1996). Caractéristiques et diagnostic de souches du virus de l'encéphalomyocardite associées aux problèmes reproducteurs et respiratoires chez les porcs.  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 217 p.

abstract:
Le virus de l'encéphalomyocardite (EMC) appartient au genre Cardiovirus de la famille
des Picornaviridae. Cet agent est reconnu comme étant responsable de problèmes de mort
subite chez les jeunes porcelets, de même que de problèmes reproducteurs chez les truies
de toutes parités en fm de gestation. Le diagnostic d'avortement associé au virus EMC n'est
souvent basé que sur la mise en évidence d'anticorps neutralisants de type IgG dans les
liquides foetaux, étant donné qu'il y a souvent absence de lésions spécifiques au niveau du
myocarde et du cerveau et étant donné les difficultés rencontrées lors de l'isolement du virus
en cultures cellulaires. Les objectifs de ce travail étaient 1) de déterminer les caractéristiques antigéniques et
moléculaires de cet agent viral, et 2) d'évaluer la sensibilité et la spécificité des techniques
PCR et d'hybridation moléculaire pour la détection du virus dans les tissus de souris et de
porcs infectés de façon expérimentale. Des isolats québécois du virus EMC ayant été
associés à des épisodes de problèmes reproducteurs et/ou respiratoires chez des truies de
toutes parités et des porcelets non-sevrés ont été comparés au cours de ces travaux. La souche Q.90-890 du virus EMC fut propagée sur culrures cellulaires Vero et purifiée
par ultracentrifugation sur gradients de densité de chlorure de césium. L'ARN génomique
fut extrait et des copies d'ADNe correspondant aux régions codant pour les protéines
structurales VPl et VP4 ont été synthétisées sous l'action de la transcriptase inverse (RT). Le choix des paires d'amorces oligonucléotidiques utilisées dans les réactions de RT et
de polymérisation en chaîne par la Taq polymérase a été fait en se basant sur la séquence
d'ADN complémentaire de la souche de référence simienne ATCC VR-129 publiée en 1984.
Les produits d'amplification ont été analysés par électrophorèse sur gels d'agarose et des
fragments de 410, 434, 461 et 806 paires de base ont été révélés. Des sondes moléculaires,
correspondant aux produits amplifiés par la technique PCR et clonés dans un vecteur
plasmidique T, ont été synthétisées et marquées à la digoxygénine-11-dUTP, suite à une
incubation en présence d'ADN polymérase T7 et d'amorces oligonucléotidiques aléatoires. La sensibilité de la technique d'amplification enzymatique pour la détection de l' ARN
viral dans les cellules Vero infectées fut estimée à 10 4 DCEP50• Une augmentation de cette
sensibilité d'un facteur de 10 (10 3 DCEP50) fut obtenue dans les cas où le produit de la
réaction PCR était révélé par hybridation à l'aide d'une sonde moléculaire homologue
(technique Southern). La spécificité des fragments génomiques amplifiés a été confirmée par hybridation
moléculaire et aucune réactivité n'a été démontrée envers le parvovirus porcin (PPV), le
virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine (RIB), les entérovirus porcins types 1, 6 et 8
(PEV) et le virus de la diarrhée virale bovine (BVD-MD). L' ARN génomique de neuf isolats du virus EMC, provenant de fermes québécoises
ayant connu une recrudescence de problèmes reproducteurs, de même que trois isolats provenant des États-Unis et de Puerto Rico, a été amplifié en utilisant trois paires d'amorces
différentes. En parallèle, des régions génomiques spécifiques du virus EMC ont été amplifiées par
PCR à partir d 'homogénats de tissus de souris infectées de façon expérimentale avec la
souche Q.90-890, à des doses de 103 et 104 DCEP50, et prélevés à différents intervalles après
le début de l'infection. L'étude de la cinétique d'infection a permis de démontrer la
présence du virus au niveau de plusieurs organes vitaux chez la souris tels le cerveau, la
rate, le coeur, les poumons et les intestins, confirmant ainsi les résultats obtenus lors
d'essais d'isolement en cultures cellulaires. Comparativement, la présence d'antigènes
viraux n'a pu être détectée qu'au niveau des intestins et du cerveau après 24 heures par la
technique d'immunofluorescence sur coupes de tissus congelés. La sensibilité de ces différentes techniques a aussi été évaluée pour la détection du virus
dans les homogénats d'organes prélevés de porcelets ayant été infectés avec l'isolat Q.90-
890 à une dose de lOS DCEP50• Lors d'analyses histopathologiques, il fut possible de mettre
en évidence des lésions de myocardite et d'encéphalite nécrotiques chez les porcelets dès le
4ième jour suivant l'infection. Toutefois, la présence d'antigènes viraux n'a pu être
démontrée par immunofluorescence sur coupes de tissus. Lors d'essais d'isolement en
cultures cellulaires, le virus fut cultivé à partir d'homogénats de coeur, de poumons, de
cerveau et de rate. Les essais effectués avec les techniques PCR et d'hybridation moléculaire ont permis de détecter la présence d'ARN viral dans les
homogénats préparés à partir du coeur, du cerveau et de la rate. La combinaison des techniques PCR et d'hybridation moléculaire s'est donc avérée
d 'une sensibilité supérieure aux techniques conventionnelles de détection. De plus, les
résultats peuvent être obtenus en moins de 5 jours, comparativement à la période de trois
semaines nécessaires à la confrrmation de l'isolement en cultures cellulaires. Ces techniques
moléculaires sont très spécifiques et la présence d'anticorps bloqueurs retrouvés
normalement dans les tissus d'avortons ou de porcelets immunocompétents n'interfère pas
au niveau de leur efficacité. Au cours de ces travaux, 9 isolats québécois du virus EMC, ayant été associés à des
épisodes de problèmes reproducteurs etfou respiratoires et récupérés chez des truies de
toutes parités et des porcelets non-sevrés, ont été analysés pour fm de comparaison du point
de vue antigénique et génomique afin de vérifier la possibilité de retrouver des variants
associés à des tropismes distincts. Dans un premier temps, des épreuves sérologiques ont
été effectuées et n'ont permis de révéler aucune variabilité notable entre les divers isolats
sauf pour les isolats respiratoire Q. 90-890 et abortif Q. 90-6041, qui ont démontré un titre
très inférieur par le test de séroneutralisation ainsi qu'un profil d'immunobuvardage en
partie différent de celui obtenu pour les autres isolats porcins québécois. Du point de vue
génomique, une analyse des séquences des isolats québécois d'origine respiratoire Q.90-890
et Q. 90-945 a permis de déceler quelques substitutions nucléotidiques se traduisant toutes par des changements au niveau des peptides, pouvant être à la source des variations
observées au niveau du tropisme viral.


identifier: Dicko, Ousmane-Amirou  (1996). Étude exploratoire des interactions du bacillus thuringienesis et du virus de la granulose che« la tordeuse des bourgeons d'épinette (Choristoneura fumiferana) (Clem.) (Lepidoptera Tortricidae)  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 182 p.

abstract:
Choristoneura fumiferana (Clemens), plus connue sous le nom de la
tordeuse des bourgeons de l'épinette (TBE), est un lépidoptère ayant des
incidences économiques au Canada et aux États-Unis. Parmi les microorganismes
entomopathogènes efficaces contre cet insecte, on retrouve
Bacillus thuringiensis var kurstaki HD-1 (B.t.k. HD-1) et le virus de la
granulose de C. fumiferana (CfGV) qui possèdent les critères de spécificité et
de sécurité essentiels pour leur utilisation dans un programme de contrôle
biologique des populations de la TBE. Dans cette optique, partant d'un échantillon de plus 2000 larves de C.
fumiferana prélevées sur le terrain, la présence du CfGV dans la population
naturelle de l'insecte a été confirmé par les techniques du dépôt direct et de
l'hybridation moléculaire. Par la suite, des doses létales (DLso), de 105
granules pour le CfGV et de 5.5 ng en qui concerne le B.t.k. souche HD-1, ont
été obtenu suite à des essais biologiques pratiqués sur un lot de plus de 2000
larves de TBE en élevage. L'utilisation concomitante de ces deux
préparations insecticides a permis de mettre en évidence, non seulement
l'existence des effets synergiques sur la mortalité, mais aussi un plus grand
ralentissement dans le développement des différents stades larvaires chez la
TBE. Ainsi, ces résultats représentent une étape importante dans le
développement des conditions d'application du CfGV dans les programmes
de lutte contre la tordeuse. Les approches utilisées et les résultats obtenus nous permettent de
tirer quelques conclusions sur la dynamique du virus de la granulose
(CfGV) dans la population larvaire de la C. fumiferana en plus d'évaluer le
potentiel du traitement combiné du CfGV et du B.t.k. HD-1 en lutte
biologique. L'approche développée lors de la présente étude, en plus
d'ouvrir la voie sur d'autres projets de recherches reliés au virus de la
granulose de C. fumiferana, est utilisable pour le développement d'outils de
lutte biologique contre d'autres insectes ravageurs de la forêt et du milieu
agricole.


identifier: Chalifour, Anick  (1996). La protéine BICP27 du virus de l'herpès bovin de type 1: cinétique d'expression au cours du cycle infectieux et développement d'une lignée cellulaire BICP27+  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 156 p.

abstract:
Le virus de l'herpès bovin de type 1 (BHV-1) cause des affections majeures des
systèmes respiratoires et génitaux des bovins. Malgré l'utilisation de différents types de
vaccins conventionnels, l'infection causée par le BHV-1 est en nette progression.
L' identification de gènes viraux essentiels à la réplication virale permettrait d'ouvrir la voie
au développement de vaccins beaucoup plus efficaces et plus sécuritaires par la création de
virus vivants (efficacité), mais complètement déficients dans leur réplication (inocuité).
L'un des gènes potentiels pouvant mener au développement d'un tel vaccin est celui codant
la protéine BICP27, car il a été démontré que le gène homologue icp27 chez l'herpès
simplex de type 1 (HSV-1) est essentiel à la réplication virale. Dans le but d'obtenir des
évidences préliminaires sur la similarité fonctionnelle des deux gènes viraux, nous avons
entrepris d' étudier la cinétique d'expression transcriptionnelle et traductionnelle du gène
bicp27. Pour réaliser ces travaux, le polypeptide viral complet a été exprimé chez
Escherichia coli puis utilisé pour générer un sérum monospécifique. Le sérum immun
obtenu a permis la détection d'une protéine virale spécifique de 49 kiloDalton dans les
lysats de cellules MDBK infectées par le BHV-1, dont la masse corrélait bien avec celle
attendue de 45,4 kiloDalton. L'accumulation du polypeptide dans les cellules infectées
débutait 3 heures suite à l'infection, son abondance était maximale à 15 heures postinfection,
puis décroissait graduellement jusqu'à 24 heures post-infection. Une analyse de
type Northem des ARNs totaux isolés de cellules infectées pour différentes périodes a
permis la détection d'un transcrit viral spécifique de 1,7 kb. Le profil d'expression du transcrit était similaire à celui de la protéine. Les résultats obtenus indiquent que le gène
bicp27 appartient à la classe cinétique p et non pas a comme il avait été démontré pour
I'icp27 du HSV-1. Par ailleurs, alors que I'icp27 s'exprime de façon brève dans le cycle
réplicatif du HSV -1, son homologue présente une expression continue. Nos travaux
suggèrent donc que la fonction du gène bicp27 est différente de celle de 1'icp27. En parallèle à ces travaux, nous avons développé une lignée MDBK exprimant de
façon constitutive la protéine BICP27 du BHV -1. Ce type de lignée pourrait
éventuellement être utilisé pour maintenir la croissance d'un mutant de délétion BICP2T
du BHV-1, mutant qui permettrait d'identifier le rôle de la BICP27 dans la réplication
virale in vitro et in vivo.


identifier: Bizouarn, Francisco  (1996). Étude de la régulation du complexe ligno-cellulotytique de Streptomyces lividans  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 178 p.

abstract:
Trois méthodes de mutagénèse ont été utilisées lors de ces travaux: la mutagénèse par
élimination d'un site de restriction unique (SRU), la méthode de Kunkel (simple brin polyuracil)
et la mutagénèse par amplification élective à l'aide de la polymérase (PCR). La méthode la plus
puissante était cette dernière car elle permet de produire facilement des mutants. Cette méthode
permet entre autre, l'examen de la progression de la mutagénèse à chaque étape. Le gène codant pour la biosynthèse de la cellulase A de S. lividans 1326 a été muté
afin de modifier le codon d'initation TTG en ATGet le codon suivant AAA en AAG. La
mutation du codon de départ double la production de cellulase A comparée à celle du gène
sauvage . Par contre, la mutation du codon AAA en AAG diminue la production de cellulase A
à 500% de celle du sauvage. Le double mutant ATG-AAG donne une production de cellulase A
approximativement équivalente à celle du clone sauvage. Le gène de la cellulase B a dans sa séquence codant le peptide signal deux codons TT A
dont r ARNt est codé par le gène bldA qui n'est exprimé que lors du métabolisme secondaire.
La production de cellulase B par la souche sauvage est extrêmement faible due à cette
régulation. Les clones dont l'un des codons TT A est remplacé par un CTG produisent la
cellulase B dès le départ en quantités nettement supérieures à celle de la souche sauvage mais
de façon encore relativement faible. Par ailleurs, le double mutant n'ayant plus la restriction
imposée par l'ARNt produit huit fois plus de cellulase B que la souche sauvage. Le clonage des
gènes mutés Tl (mutant pour le premier codon TTA), T2 (double mutant), T3 (mutant pour le
deuxième codon TT A), du gène sauvage (WT) et du contrôle négatif (pSUR) dans la souche S.
lividans 11725 (souche b/dA) donne un taux de sécrétion de cellulase B similaire à celui
produit par S. lividans 1326. Deux gènes hybrides ont été construits comportant la séquence du promoteur, du site
de fixation des ribosomes et du peptide signal de x/nA et la séquence codant la protéine mature
de la cellulase A ou de la cellulase B. Ces gènes hybrides ont été construits afin d'outrepasser les restrictions imposées par les codons du peptide signal des gènes celA et celB et pour
profiter de la puissance du promoteur de xlnA. Dans la souche S. lividans 1326, le clone
porteur du gène hybride x/nA-celA produit deux fois plus de cellulase A que le gène ce/A.
Enfin, le clone avec le gène xlnA-ce/B produit au delà de 40 fois plus de cellulase B que le
clone avec le gène sauvage celB.


identifier: Michel, Paul  (1996). Effets des composés volatiles générés par irradiation du polyéthylène sur une flore microbienne alimentaire.  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 152 p.

abstract:
Pseudomonas fragi, Candida albicans et Aspergillus flavus
ont été exposés aux composés volatils générés par un polyéthylène
de basse densité (PEBD) de grade alimentaire lors d'une
irradiation gamma (60co) à 0,25, 0,5 et 2,0 kGy respectivement.
Seul le taux de survie à l'irradiation de Pseudomonas fragi
était différent après une exposition aux composés volatils.
Lorsqu'un film de PEBD de fabrication récente (1 an) était
employé, le taux de survie de ce microorganisme était plus
faible en présence des composés volatils (effet significatif au
seuil de a= 0,05). En utilisant un PEBD de fabrication de
longue date (10 ans), le taux de survie était plus grand en
présence des composés volatils (effet significatif au seuil de
a= 0,05). L'effet des composés volatils n'était pas modifié
par une augmentation de la quantité de PEBD de 2 à 20 cm2;ml
d'air. L'activité biochimique de Pseudomonas fragi et candida
albicans a été vérifiée et ne semblait pas être affectée de
façon importante par la présence des composés volatils générés
à o, 25 et 2 kGy respectivement. L'apparence sur gélose
d'Aspergillus flavus ne semblait pas être touchée par les
composés volatils produits à 0,5 kGy. L'analyse des composés volatils a été complétée par chromatographie
en phase gazeuse et spectrométrie de masse. Le
profil des composés volatils du PEBD variait avec 1' âge du matériau. A la dose d'irradiation de Pseudomonas fragi (0,25
kGy), la majeure partie de ces composés ont été identifiés
comme étant des aldéhydes aliphatiques (hexanal, heptanal,
octanal, nonanal et decanal). Des différences majeures ont été
notées entre les PEBDs de 1 et 10 ans. Le PEBD de 1 an
produisait un benzène substitué (1,3-di(tert-butyl)-benzène) en
concentration relativement importante. Le PEBD de 10 ans
générait plusieurs cétones (6-méthyl-5-heptène-2-one, 2-
nonanone, 2- decanoneet1,7,7-trimethyl-bicyclo(2.2.1)-heptane-
2-one) ainsi que deux alcools (1-heptanol et 1-octanol). Ces
différences entre les deux plastiques pourraient être responsables
des effets contraires observés sur le taux de survie à
l'irradiation de Pseudomonas fragi et mériteraient d'être
étudiées plus à fond.


identifier: Touré, Ousmane  (1996). Étude de la biodégradation du phénol par phanerochaete chrysosporium (ATCC-24725) et pleurotus sajor-caju (NRRL-18757).  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 153 p.

abstract:
L'Agence de Protection de l'Environnement des États Unis (USEPA)
considère le phénol comme polluant majeur de l'eau et des sols, soit
directement, soit comme intermédiaire de dégradation d'autres composés
phénoliques. Il existe de nombreux procédés de détoxification du phénol, mais
la plupart de ces procédés sont le plus souvent onéreux et introduisent dans la
nature d'autres produits généralement plus toxiques que Je phénol lui même,
exposant ainsi notre écosystème et notre santé à des risques majeurs et parfois
irréversibles de détérioration. La dernière décennie a vu la vulgarisation des
procédés biologiques de dégradation des xénobiotiques. Ces procédés
biologiques, même s'ils sont plus sécuritaires et constituent un champ
d'investigation et de recherche prometteur offrant d'immenses potentialités ,
demeurent cependant relativement sous-exploités, ils ne représentent que 6%
des procédés de détoxification utilisés. D'où la recherche constante de
microorganismes toujours plus performants dans la biodégradation. C'est dans cette optique que nous avons choisi d'étudier l'activité
biodégradante du phénol de deux Basidiomycètes ligninolytiques:
Phanerochaete chrysosporium ATCC # 24725 et Pleurotus. sajor-caju NRRL
# 18757. Les ligninases sont des enzymes qui, en plus de leur potentiel de
dépolymérisation de la lignine, ont une grande activité non spécifique leur
permettant de dégrader un très grand nombre de produits toxiques. Le choix de P. chrysosporium se
justifie par le fait qu'il a été largement étudié comme agent biodégradeur, celui
de P. sajor-caju se justifie par le fait qu'une étude antérieure faite dans notre
laboratoire lui reconnaissait le pouvoir de transformer la lignine en oligolignols
de faible poids moléculaire. Mais aucune étude n'a jusqu'à date utilisé P. sajorcaju
pour la biodégradation du phénol. La présente étude porte donc sur la dégradation du phénol par ces deux
microorganismes sous diverses conditions physiques et chimiques. P. sajorcaju,
bien que n'ayant pas une très grande activité ligninolytique connue , a pu,
dans nos conditions expérimentales, dégrader plus de phénol et cela en moins
de temps que P. chrysosporium. Il ressort de notre étude que les deux
microorganismes étudiés présentent une très bonne tolérance à de fortes
concentrations de phénol (jusqu'à 800 ppm) sur milieux liquide et solide. Le pH
optimal de dégradation du phénol des deux champignons sont assez proches
même si dans le cas de P. sajor-caju, le pH optimum de dégradation ne
correspond pas à celui de croissance. En ce qui concerne l'âge de la culture au
moment de l'addition du phénol, nous avons observé des comportements tout
à fait différents. En effet, plus les cultures de P. chrysosporium étaient âgées,
plus tôt commençait la dégradation et plus importante était la quantité de phénol dégradée, tandis que chez P. sajor-caju, les cultures fraîches se
sont montrées plus performantes que celles âgées. La concentration en azote
ne nous a pas semblé jouer de rôle très important sur la capacité de
dégradation du phénol par P. sajor-caju contrairement à P. chrysosporium ,
même si un certain rapport C: N est nécessaire pour les deux microorganismes.
Nous avons toutefois noté qu'un excès d'azote dans le milieu de culture avait
un effet inhibiteur sur la croissance et le potentiel de dégradation des deux
champignons. L'adaptation à de fortes concentrations de phénol a été
bénéfique pour les performances de dégradation du phénol par les deux
microorganismes, mais, même dans ces conditions, celles de P. sajor-caju
étaient de loin meilleures. Nous avons aussi testé l'effet de diverses sources de
carbone sur la dégradation du phénol, et, c'est la paille de blé délignifiée
(substrat le moins dispendieux) qui a donné les meilleurs résultats. Nous avons
noté que la température optimale de dégradation du phénol par P. sajor-caju
ne correspond pas à sa température optimale de dégradation de la lignine. Les
deux champignons se sont avérés inefficaces en cultures stationnaires, la
vitesse optimale d'agitation a été de 200 tpm. P. sajor-caju a très peu dégradé
le phénol in vitro (moins de 20% en 7 jours) tandis que P. chrysosporium a
dégradé dans ces conditions, 60% du phénol en 7 jours. Le principal
intermédiaire de la dégradation, le pyrocatéchol, est identique à celui habituellement reconnu aux champignons et aux bactéries. Quelles que soient
les conditions expérimentales, P. sajor-caju a été de loin le plus efficace, hormis
la dégradation in vitro. P. sajor-caju constitue un bon choix lorsque l'on
s'intéresse à la bioremédiation de sites contaminés au phénol par des
champignons.


identifier: Bélizaire, Anna-Karine  (1996). Influence du virus du papillome humain sur l'évolution clinique des lésions préinvasives cervicales  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 154 p.

abstract:
Dans le cadre de ce projet de maîtrise nous avons tenté de détenniner si la présence
de l'acide désoxyribonucléique (ADN) du virus du genre papillomavirus (HPV) influençait
le taux de récidive de patientes traitées pour des lésions cervicales préinvasives. Pour cette
étude rétros-pective cas-témoin qui couvre une période de 5 ans, nous avons utilisé les
données de plus de 3000 patientes traitées pour une lésion préinvasive cervicale à l'HôtelDieu
de Montréal. De celles-ci, nous en avons retenu une centaine qui répondaient à nos
critères. La population fut séparée en deux groupes. Le groupe des cas était constitué de
patientes (n =55) ayant récidivé suite au traitement (i.e diagnostiqué pour une seconde
lésion cervicale), après une période d~au moins douze mois, le groupe témoin comprenait
les patientes (n =55) qui n'ont pas récidivé et dont le suivi médical durait une période d'au
moins 21 mois. Ces deux groupes furent appariés selon l'âge(± 5 ans), la lésion, le
traitement et l'année du diagnostic(± 1 an). Les échantillons obtenus des archives du département de pathologie furent analysés
par réaction de polymérisation en cascade (PCR). Après vérification de la qualité des
échantillons, 89,6% des échantillons furent retenus. La population étudiée était homogène car nous avons comparé deux groupes de
patientes ayant eu la même maladie. En effet, nos résultats n'ont révélé aucune variation
significative entre les cas ayant récidivés et les témoins concernant le coïtarche, la
cohabitation et la parité. Toutefois, l'infection par M.T.S., particulièrement à Candida albicans était significativement plus importante pour les cas que pour les témoins, p =
0,003. Les patientes traitées pour une lésion HPV positive étaient plus agées, avec 95,8%
des patientes âgées de plus de 30 ans comparativement à 66,7% âgée entre 18 et 24 ans, p =
0,018. La lésion traitée était significativement plus sévère chez: les patientes HPV positives
(p = 0,034), les patientes plus agées au premier traitement avec 42,1% des plus de 30 ans
ayant été traitée pour une lésion CIN 3-CIS comparativement à 2,6 % des patientes âgées
entre 18 et 24 ans (p < 0,001 ). La lésion traitée était aussi en général plus sévère chez les
femmes cohabitant avec leur partenaire (p = 0,008) et chez celles ayant au moins 1 enfant
(p = 0,031). Le coïtarche et les M.T.S. ne semblent pas influencer le grade de la lésion
traitée. Le fait d'avoir été traité pour une lésion HPV positive ou négative n'a pas influencé
le temps de récidive et cette étude rétrospective n'a pas mis en évidence de relation entre le
HPV et le risque de récidive. En effet, 70,3% des cas ayant récidivé avaient été traitées pour
une lésion HPV positive comparativement à 66,7% des témoins. Avec ces résultats nous
avons obtenu un risque relatif de récidive 1 ,5 fois plus élevé chez les lésions HPV
positives, cette augmentation n'est toute fois pas significative. Seul l'infection par une M.T.S. après traitement a augmenté le risque de récidive.
Ce risque est 6,5 fois plus élevé chez les femmes infectées après traitement (95%CI =
1,467-28,804).

The purpose of this project was to determine if the presence ofhuman
papillomavirus (HPV) influenced the recurrence rate of patients treated for a preinvasive
cervical lesion. In his retrospective nested case-control study spans which 5 year period, we
analysed hospital data of more than 3000 women treated at the Hôtel-Dieu de Montréal a
downtown Montreal hospital. Of these a 11 0 fulfilled the required criteria. The study
population was divided in two groups. Cases (n =55) were defined as patients who recurred
following treatment after a period of at !east 12 months. Controls (n = 55) were defined as
patients who did not recur and whose medical file contained a follow-up of at least 21
months. Women from both groups were matched according to age(± 5 years), lesion,
treatment, and year of diagnosis (± 1 year). Biopsies were obtained from the pathology department and were analysed by
polymerase chain reaction (PCR). After quality control, 89,9% of the specimens were kept
in the study for further testing conceming HPV status. Since the groups compared both contained patients who were treated for a
preinvasive lesion of the cervix, the study population was quite homogeneous. Our results
did not show any significant variation between cases and controls conceming coitarche,
cohabitation or parity. However, infection by a sexually transmitted disease (STD)
particularly Candida albicans was significantly higher among cases p = 0,003. Women treated for an HPV positive lesion were generally older. Of the women aged 30 or higher, HPV status was positive in 95,8%, compared to 66,7% ofthose aged
18-24 years (p = 0,018). Lesion was also significantly more severe among patients treated
for an HPV positive lesions (p = 0,034) and older patients with 42,1% of the aged > 30
years treated for a CIN3-CIS compared to 2,6% ofthose aged 18-24 years (p < 0.001).
Women living with their partner (p = 0,008) and women with at ]east one child vs none (p =
0,031) also suffered from a more severe lesion. According to our results, grade of lesion did
not seem to be affected by coitarche or STD. In this study, HPV status of the treated lesion did not influence treatment-recurrence
time-interval. Neither could we show a relation between HPV and risk of recurrent lesion.
In fact, infection rates in both cases and controls were quite similar, with 70,3% of cases
and 66,7% of controls having been treated for an HPV positive lesion. These results
translate into a non significant increased risk of recurrence of 1.5 in patients treated for an
HPV positive lesion. Only infection by a STD after treatment increased risk of recurrence significantly.
Relative risk was found 6.5 times higher in women infected after treatment (95%CI =
1,467-28,804).


identifier: Langlois, Isabelle  (1996). Étude de l'expression des sous-unités de la ribonucléotide réductase de l'herpès bovin de type 1.  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 111 p.

abstract:
 Le virus de l'herpès bovin de type 1 (BHV-1) code plusieurs enzymes
dont la ribonucléotide réductase (RNR). Celle-ci est impliquée dans la synthèse
des nucléotides précurseurs de l'ADN. La RNR est constituée de deux sousunités
distinctes (petites et grosses sous-unités) présentes en quantités
stoechiométriques. Cependant, l'équivalence observée au niveau des
holoenzymes de différentes sources ne se retrouve pourtant pas au niveau des
transcrits chez le BHV-1, celui de la petite sous-unité (R2) étant plus abondant.
n était donc intéressant de déterminer si ce rapport non-stoechiométrique des
transcrits se reflétait au niveau protéique. Des sérums monospécifiques contre
chacune des sous-unités ont été produits et utilisés afin de déterminer la
cinétique d'expression de la RNR virale. Contrairement à ce qui était attendu,
l'étude montre que la grosse sous-unité (Rl) s'accumule en plus grande
abondance que la R2. La région promotrice du gène de la Rl ainsi que la région
5' non-traduite du transcrit correspondant ont été caractérisées puis comparées
à celles de la R2. Ces comparaisons nous ont permis d'émettre des hypothèses
permettant d'expliquer le fait que les rapports observés au niveau des transcrits
ne correspondent pas à ceux observés au niveau protéique.


identifier: Gagnon, Jacky  (1996). Exposition prolongée aux champs magnétiques: effets sur le système immunitaire du rat F344/N  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 124 p.

abstract:
Les champs électromagnétiques de 50-60 Hz sont omniprésents dans les pays
industrialisés. Jusqu'à présent, les études n'ont montré aucun risque de la composante
électrique pour la santé humaine et animale. Depuis l'étude de Wertheimer et Leeper en 1979,
plusieurs groupes de recherche se sont intéressés à la composante magnétique des champs
électromagnétiques. Dans ce travail nous avons étudié l'effet d'une exposition prolongée aux champs
magnétiques sinusoïdaux de 60 Hz sur différentes populations de cellules immunitaires. Dès
le vingtième jour de gestation, des rats F344/N ont été exposés à différentes intensités de
champs magnétiques (2, 20, 200 et 2000 J.LT) pendant 3, 6 et 9 mois. Selon les résultats obtenus dans cette étude, les champs magnétiques semblent
moduler de manière dose-dépendante certaines réponses des cellules spléniques, plus
particulièrement après 3 mois d'exposition. Des augmentations de l'activité des cellules NK
ont été observées avec des intensités croissantes de champs magnétiques et après 3, 6 et 9
mois d'exposition. Les pourcentages de lymphocytes T CD5+, CD4+, et CD8+ diminuaient
après 3 mois d'exposition, pour revenir à un niveau normal après 6 et 9 mois d'exposition.
Les lymphocytes B Igs+ ne semblent pas avoir été affectés par les champs magnétiques.
Après 3 mois d'exposition, l'activité IL-2 a diminué avec l'augmentation de l'intensité des
champs magnétiques; cette variation n'était plus présente après 6 et 9 mois. L'index de stimulation de la production d'H20 2 par les cellules péritonéales était peu
affecté par une exposition aux champs magnétiques. Seule une légère diminution de ce
rapport a été observée dans la population cellulaire majeure (A) après 3 et 9 mois d'exposition
et seulement par rapport au "sham". De plus les champs magnétiques ont entraîné une
augmentation de l'activité TNF-a après 3 mois d'exposition, mais ce résultat demande à être confirmé à l'aide d'un plus grand nombre d'échantillons. Finalement, les champs
magnétiques n'ont eu que peu d'effets sur les comptes leucocytaires et différentiels. Nous avons démontré que les champs magnétiques peuvent moduler, de manière
dose-dépendante, différentes réponses inununitaires et plus particulièrement après 3 mois
d'exposition. n sera donc intérressant d'étudier d'autres paramètres immunitaires et
d'évaluer l'effet d'une exposition aux champs magnétiques sur la résistance des animaux aux
infections et aux tumeurs.


identifier: Dianati, Elham  (2017). Unraveling the expression and regulation of intercellular junctions in normal and Brominated Flame Retardants (BFRs) treated murine mammary glands  Thèse.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en biologie, 209 p.

subject:
glands mammaires
murin
développement
Retardateurs de Flamme Bromée (RBF)
jonctions
interaction
connexines
cadhérine
β-caténine
p-β-catSer675. Mammary gland
Murine
Development
Brominated Flame Retardants (BFRs)
Junctions
interaction
Connexins (Cxs)
Cadherins
β-catenin
p-β-catSer675

abstract:
La structure des glands mammaires est en constant remodelage et nécessite une régulation hormonale précise. Les jonctions communicantes, serrées et adhérentes sont nécessaires pour le bon fonctionnement et développement des glandes mammaires. Il a été démontré que les protéines jonctionnelles interagissent et que leur expression est régulée par des mécanismes communs dans d’autres tissus, dont par des voies activées par les hormones. Certains perturbateurs endocriniens (EDs) peuvent également modifier l’expression des protéines jonctionnelles. Notre hypothèse de recherche est donc que l’expression des protéines jonctionnelles et leurs interactions varient selon le stade de développement des glandes mammaires, et qu’une exposition à des EDs pourrait influencer ces interactions. Ce projet compte deux objectives : 1) déterminer les profils d’expression, la localisation et les interactions de composants des jonctions intercellulaire à différents stades de développement des glandes mammaires, et 2) évaluer l’effet d’un mélange de retardateurs de flamme Bromée (BFR) sur les jonctions intercellulaires. Pour le premier objectif, des glands mammaires de souris ont été collectés à différents stades de développement. Nos résultats ont démontré que l’expression des protéines des jonctions communicantes, serrées et adhérentes étudiées est modifiée durant le développement et qu’elles sont présentes à l’interface entre deux cellules. De façon intéressante, nous avons démontré que les interactions entre les différentes protéines jonctionnelles diffèrent durant le développement. L’ensemble de nos résultats suggère que l’expression et les interactions entre les protéines jonctionnelles pourraient être régulées par les changements hormonaux, reflétant des besoins fonctionnels différents. Pour le deuxième objectif, des rats femelles ont été exposés par la diète à un mélange de BFRs avant l'accouplement jusqu’à la fin de l'allaitement, et sacrifiées au jour du sevrage. Aucune différence n’a été observée dans plusieurs protéines étudiées. Bien que les niveaux totaux de β-caténine furent inchangés, l’exposition à la dose la plus faible de BFRs a réduit la forme phosphorylée Ser675 de β-caténine (p-β-catSer675), probablement via une baisse d’activité de PKA. De plus, le traitement a diminué l'interaction entre les p-β-catSer675 et E-cadhérine. Ces résultats démontrent qu’une exposition à un mélange de BFRs affecte peu la fonction des glandes mammaires, mais peut inhiber le rôle de p-β-catser675 dans complexe d'adhésion cellulaire. L’ensemble de nos résultats démontrent que le nexus jonctionnel est en constant remodelage durant le développement des glandes mammaires, probablement en fonction des besoins fonctionnels. De plus, des EDs peuvent modifier ces interactions. Les conséquences à long terme de ces perturbations restent à déterminer.

 Mammary glands undergo diverse structural changes across the mammals’ life span. Cell-cell interactions by means of Gap (GJs), Tight (TJs) and Adherens junctions (AJs) providing cross-talk between epithelial cells, are required for proper function and development of the gland. It has been shown that junctional proteins interplay regulates each other’s function in other tissues. Mammary glands’ development is also tightly regulated by hormones. Because junctional proteins expression is also influenced by hormones, exposure to some endocrine disruptors (EDs) was reported to abrogate intercellular junctions. The objectives of this research were to: 1) assess the expression profile, localization as well as interaction of GJs, TJs and AJs across post-natal mammary gland development, and 2) evaluate the effect of brominated flames retardants (BFRs) on intercellular junctions. For the first objective mammary glands from mice were sampled at various developmental stages. RT-qPCR and western-blot demonstrated differential expression pattern for all members of gap, tight and adherence junctions tested across development. Immunofluorescence showed that junctional proteins were localized at the cell-cell interface suggesting the existence of a junctional nexus. Co-immunoprecipitation established that junctional protein interplay together and form nexuses which are specific to different stages of development. Our results established that junctional interactions vary throughout development, likely following hormonal changes, and suggest that these interactions might regulate mammary gland function and stability of the nexus at cell membrane. For the second objective, female rats received different doses of a BFRs mixture prior to mating until weaning day when mammary glands were collected. Western blot showed that BFRs had no adverse effect in milk synthesis, hormonal receptors and intercellular junctions. While BFRs did not change β-catenin levels, it resulted in a significant down-regulation in phospho-ser675 β-catenin (p-β-catSer675) at low dose, likely in a PKA-dependent manner. Co-Immunofluorescence assay showed that p-β-catSer675 is localized at cell membrane and confirm the decreased levels at low and medium doses. Finally, our results established that the interaction between p-β-catSer675 and E-cadherin is reduced in low dose treated animals. These results suggested that while BFRs exposure did not result in major functional issues, it did affect the role of p-β-cateninser675 in cell adhesion. Together, our results demonstrated that junctional nexus are in constant remodeling during mammary gland development, likely reflecting the needs for cell-cell interactions. Moreover, EDs can impact these interactions by affecting cell signaling. More studies are required to fully understand the long-term impacts of these dysregulations.


identifier: Etty, Marie-Christine  (2017). Développement d'un kit d'immunio-détection rapide et spécifique de l. monocytogènes sur une membrane à base de biopolymère pour les surfaces en industrie alimentaire.  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 196 p.

abstract:
Face au défi que représente le temps d’analyse des méthodes de détection officielles existantes, le développement d’une méthode de détection basée sur le couplage de l’étape d’enrichissement sélectif de Listeria monocytogenes et de sa détection spécifique représente une solution potentielle à l’amélioration de sa surveillance en santé publique. Dans cette optique, des travaux de recherche ont été effectués sur la protéine p60 impliquées dans la virulence et la croissance de L. monocytogenes. Cette protéine p60 a été choisie puisqu’elle contient une séquence de 11 acides aminées (peptide D ou PepD : QQQTAPKAPTE) unique à l’espèce Listeria monocytogenes. Ainsi, les résultats obtenus permettent de montrer que le milieu Listeria enrichment broth (LEB) est le meilleur milieu d’enrichissement sélectif favorisant une meilleure croissance de L. monocytogenes et une meilleure expression de la protéine p60 (Beauchamp et al., 2012b; Coutu et al., 2014). Néanmoins, l’expression de la protéine p60 dans le LEB est retardée par la présence d’agent sélectif. D’où, la modification du LEB à une concentration optimale de 0,5% de dextrose (LEB modifié) a été effectuée afin de favoriser l’expression précoce de la protéine p60. Par la suite, une membrane (CCG)à base de chitosane (Cs), de nanocristaux de cellulose (CNC) et de glycérol (Gly) a été développée dans le but d’immobiliser des anticorps monoclonaux anti-peptide D de la protéine p60 de L. monocytogenes (mAb anti-PepD). La caractérisation des composantes de la membrane CCG a permis de mettre en évidence la présence de groupements amines (NH2) provenant du chitosane. Par ces groupements amines, une liaison covalente entre la membrane CCG et les groupements amines présents dans mAb anti-PepD a été mis en place via le glutaraldéhyde. L’optimisation de cette méthode a mis en évidence l’importance du renforcement de la résistance de la membrane CCG par la CNC sur l’efficacité d’immobilisation. La validation du support optimisé pour l’immobilisation de mAb anti-PepD dans le LEB modifié a montré que la détection spécifique de la protéine p60 de L. monocytogenes n’est pas affectée sur la membrane CCG et est plus efficace que la méthode faisant intervenir l’utilisation d’une microplaque standard. Enfin, le transfert de la membrane CCG en une version applicable dans une trousse de détection des échantillons environnementaux a permis de réduire le temps d’analyse à moins de 48 heures pour une contamination de 102 UFC/900cm2 de L. monocytogenes. Néanmoins, une réduction des interactions non-spécifiques est nécessaire sur cette version potentielle de la membrane CCG de la trousse de détection afin que la spécificité de mAb anti-PepD ne soit pas affectée.

 In order to overcome the problems associated with the time of analysis using the standard methods of detection, the development of a detection method based on the coupling of the selective enrichment step of L. monocytogenes and its specific sensing represents a potential solution to improve its surveillance in public health. To this end, this research has been performed on the p60 protein involved in the virulence and growth of L. monocytogenes. This p60 protein was also chosen because it contains a short sequence of eleven amino acids (peptide D or pepD: QQQTAPKAPTE) unique to L. monocytogenes. The results obtained showed that Listeria Enrichment Borth (LEB) is the best selective enrichment medium to improve the growth of L. monocytogenes and the expression of its p60 protein (Beauchamp et al 2012b; Coutu et al, 2014). This p60 protein is suitable for the detection of L. monocytogenes due to its involvement in growth and virulence. However, the expression of the p60 protein in LEB is delayed by the presence of selective agents. Hence, the modification of LEB at an optimal concentration of 0.5% dextrose (modified LEB) was performed to promote an early expression of the p60 protein. Subsequently, a membrane (CCG) based on chitosan (Cs), cellulose nanocrystal (CNC) and glycerol (Gly) was developed in order to immobilize a monoclonal antibody that recognizes peptide D of the L. monocytogenes p60 protein (anti-PepD mAb). The chemical characterization of the CCG membrane confirmed the presence of free amino groups provided by chitosan. With these free amino groups on the surface of the CCG membrane, a covalent link between the free amino groups on the surface of the CCG membrane and the free amino groups of the anti-PepD mAb was established using glutaraldehyde. The optimization of this immobilization method was performed and showed that the reinforcement of the CCG membrane by CNC is important for the immobilization efficiency. The use of the optimized support in the modified LEB for the detection of L. monocytogenes p60 protein was not affected on the CCG membrane and was more effective than the standard microplate detection method. Finally, the transfer of the CCG membrane to an applicable version of a detection kit for an environmental sample resulted in a reduction of the detection time to less than 48 hours for a contamination of 102CFU/900cm2 of L. monocytogenes. However, a reduction in non-specific reactions is required on this potential version of the CCG membrane to improve the specificity of detection with anti-PepD mAb.


identifier: Harich, Mehdi  (2017). Mise au point de méthodes antimicrobiennes pour application sur des produits prêts à manger  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 183 p.

abstract:
Malgré le développement technologique dans les industries alimentaires et la mise en place de normes permettant d’assurer la salubrité des aliments telle que la norme d’analyse des dangers et le contrôle des points critiques, la contamination d’aliments reste élevée d’où le nombre de maladies alimentaires qui ne cesse d’augmenter.Les fruits et légumes sont riches en nutriments tels que les vitamines, les polyphénols, les fibres et les sucres (Anses, 2016). Seulement, ils sont reconnus comme des vecteurs importants de transmission d’agents pathogènes tels qu’Escherichia coli, Listeria monocytogenes et Salmonelle qui peuvent proliférer au cours du stockage, du transport ou de la manipulation. Certains pathogènes sont responsables d’intoxications, infections et toxi-infections alimentaires, par exemples : E. coli peut causer une colite hémorragique, le syndrome urémique hémolytique et le purpura thrombocytopénique thrombotique, L. monocytogenes peut causer la listériose et affecte généralement les femmes enceintes, les personnes immunodéprimées et les personnes âgées. Les aliments prêts à manger sont également une source importante de contamination, en effet au cours des manipulations de ces fruits et légumes le risque de contamination augmente surtout lors de la découpe de ces aliments, le transport de ces derniers peut être à l’origine d’une contamination ainsi qu’au cours de l’entreposage.L’utilisation de désinfectants chimiques tel que le chlore pour décontaminer les fruits et légumes peut former des produits cancérigènes en réagissant avec la matière organique. D’où l’intérêt de l’utilisation des méthodes de décontamination non conventionnelle et non chimique. En effet, l’utilisation de chlore pour le traitement des fruits et de végétaux peut induire des saveurs désagréables et altérer le goût.Les objectifs de ce mémoire seront de tester et de trouver des méthodes de conservation pour les fruits et légumes prêts à manger, sans utilisation de produits chimiques (chlore, benzoate de sodium etc).
Les résultats montrent que le jus de canneberges vaporisé sur les poivrons et canneberges a éliminé significativement les bactéries pathogènes. De plus, les deux formulations étudiées F2 et F6 ont révèlé une activité antibactérienne importante contre E. coli, Listeria et Salmonella dans les differents fruits et légumes testés. Il a aussi été démontré que l’extrait d’agrumes FOODGARD a réduit et inhibé les pathogènes alimentaire, la flore totale et les levures et moisissures dans les garnitures de fruits. La mise au point d’une formulation X1+DF a aussi diminué significativement les microorganismes testés. De plus, l’utilisation de l’ozone gazeux et de l’irradiation a permis une inhibition totale des pathogènes. Ainsi, les résultats obtenus suggèrent que les formulations mises en place ont permis la réduction significative et l’inhibition des pathogènes alimentaires dans les légumes et fruits prêts à manger. Les techniques mises au point au laboratoire seront ainsi appliquées en industrie de transformation alimentaire.


identifier: Helal, Ibtissem  (2017). Traduction de la xylanase a chez streptomyces lividans : influence de séquences complémentaires à l’ARNr 16s  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Maîtrise en sciences expérimentales de la santé, 121 p.

abstract:
Pour les applications étendues de Streptomyces lividans et la remarquable exigence du marché, trouver de nouvelles souches de S. lividans capables de produire de la xylanase avec de nouvelles propriétés est devenu un des sujets importants dans la recherche industrielle, bio-alimentaire et environnementale. En particulier, les xylanases revêtent une grande importance pour les industries de bio-blanchiment des pâtes de papier. Ainsi, il nous apparaissait intéressant d’élaborer une souche hyper-productrice de cette enzyme. Certaines études ont montré que la sécrétion de la xylanase A chez S. lividans est nettement améliorée avec le remplacement du peptide signal (ps) de la xln A par celui du long peptide signal de la cellulase A, et ce, grâce à la présence de séquences de 6,7 ou 8 nucléotides que ce ps contient et qui présentent une complémentarité à l’ARNr 16S.Au cours de ce travail, nous avons émis l’hypothèse que ces séquences d’intérêt de 6 à 8 nt, si elles se retrouvent dans le gène de structure de la xylanase A, elles pourraient influencer la traduction de cette enzyme. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons recherché ces séquences d’intérêt dans le gène de structiure de la XlnA chez S. lividans par alignement de la séquence du gène avec celle de l’ARNr 16S. Nous avons ainsi, localisé 4 séquences de 6 nt chacune, que nous qvons appelé “boîtes”. Celles-ci existent aux positions 181-186, 293-298, 427-432 et 735-740 dans le gène. Afin d'étudier l’importance de chacune de ces boîtes dans la production de l’enzyme Xln A par S.lividans, nous avons mis au point une méthode de transformation génétique permettant d’optimiser la production de la xylanase A via la mutagenèse dirigée en changeant, une base nucléotidique, dans chacune de ces “boîtes”, par une autre différente tout en conservant l’acide aminé produit. Nous avons ainsi essayé de créer 4 nouveaux mutants de XlnA chez S. lividans par mutagenèse dirigée par PCR en incorporant les boîtes mutées par effet cumulatif. Nous avons réussi à créer 3 nouveaux mutants seulement: pIAF_907.1 ayant la première boîte mutée, pIAF_907.2 ayant les deux premières boîtes mutées et pIAF_907.3 ayant les trois premières boîtes mutées. Le quatrième mutant pIAF_907.4 n’a pas vu le jour, pourtant la mutation de la quatrième boîte a été générée par PCR. Les essaies étaient répétés 3 fois consécutives. Le mutant de S. lividans, pIAF_907.3 présente une performance élevée à la production de l’enzyme xylanase A (1150UI après 144h) en comparaison avec la structure native du clone pIAF_911.A9 (770UI) chez S. lividans. En effet, grâce à notre étude, nous avons été en mesure de produire plus de 3g/l de xylanase obtenue avec la souche dépourvue des trois séquences de 6 nt complémentaires à l’ARNr 16S. Nous avons observé un effet inverse, alors qu’on s’attendait à une baisse remarquable de la production de la XlnA chez pIAF_907.3, après la destruction de 3 régions de complémentarité avec l’ARNr 16S. La construction du mutant pIAF_907.3 pourvue d’une complémentarité diminuée à l’ARNr 16S stimule, quand même, la production de la xylanase A. Au cours de ce travail, nous avons montré que la mutation de la première boîte de complémentarité de 6nt à l’ARNr 16S, améliore la production de la xylanase A de 15,7% chez S. lividans. La mutation consécutive dans chacune des deux premières boîtes a entraîné une réduction de 40,26% de l'activité xylanolytique, ce qui montre l'importance de la séquence de la boîte 2 dans Le processus de traduction de Xylanase A dans S. lividans, lorsqu'il est associé à la boîte 3 intacte. D'autre part, la modification des trois premières boîtes a stimulé la production de xylanase de 48,4% en comparaison avec la construction native du gène de la XlnA.

For the extensive applications of Streptomyces lividans and the remarkable market demand, finding new strains of S. lividans capable of producing xylanase with new properties has become an important topic in industrial, bio-food and environmental research. In particular, xylanases are of high importance for the bio-bleaching industries of paper pulp. Thus, it appeared interesting to develop a hyper-producing strain of this enzyme. Some studies have shown that the secretion of xylanase A in S. lividans is markedly improved by replacing the Xln A signal peptide (ps) with that of the long ps of cellulase A by the presence of sequences of 6, 7 or 8 nucleotides which this ps contains and which exhibit complementarity to the 16S rRNA.In this work, we hypothesized that these sequences of interest of 6 to 8 nt, if they occur in the xylanase A structural gene, could influence the translation of this enzyme. To verify this hypothesis, we searched these sequences of interest in the XlnA structural gene in S. lividans by aligning the gene sequence with that of 16S rRNA. We have thus located 4 sequences of 6 nt each, which we call "boxes" which exist at positions 181-186, 293-298, 427-432 and 735-740 in the gene. In order to study the importance of each of these boxes in the production of the Xln A enzyme by S. lividans, we have developed a genetic transformation method to optimize the production of xylanase A via site-directed mutagenesis by changing, a nucleotide base, in each of these "boxes", to a different one while retaining the produced amino acid. We have thus tried to create 4 new XlnA mutants in S. lividans by PCR-site-directed mutagenesis by incorporating cumulatively mutated boxes. We managed to create 3 new mutants only: pIAF_907.1 having the first mutated box, pIAF_907.2 having the first two mutated boxes and pIAF_907.3 having the first three mutated boxes. Experiements were not successful obtaining the fourth mutant pIAF_907.4, yet the mutation of the fourth box was generated by PCR. The trials were repeated 3 times consecutively. PIAF_907.3 showed high production performance of the xylanase A enzyme (1150 IU after 144 h) in comparison with the native structure of the clone pIAF_911.A9 (770 IU) in S. lividans. Indeed, thanks to our study, we were able to produce more than 3 g / l of xylanase obtained with pIAF_907.3, strain lacking the three sequences of 6 nt complementary to the 16S rRNA. We observed an inverse effect, whereas a remarkable decrease in the production of XlnA was expected in pIAF_907.3 after the destruction of 3 16S rRNA complementarity sites. The construction of mutant pIAF_907.3 having reduced complementarity to 16S rRNA still stimulates the production of xylanase A. In this work, we showed that the mutation of the first 6nt complementarity box to 16S rRNA improves the production of xylanase A by 15.7% in S. lividans. The subsequent mutation in each of the first two boxes resulted in a 40.26% reduction in xylanolytic activity, which demonstrates the importance of the box 2 sequence in the Xylanase A translation process in S. lividans. On the other hand, the modification of the first three boxes stimulated xylanase production by 48.4%.


identifier: Kleinert, Christine  (2017). Immunotoxic Impact of Pharmaceuticals on Harbor Seal (Phoca vitulina) Leukocytes  Thèse.  Québec, Université du Québec, Institut national de la recherche scientifique, Doctorat en biologie, 184 p.

abstract:
La contamination anthropogénique des régions côtières et estuaires a des conséquences pour la santé de l’écosystème. L'exposition des organismes de niveau trophique aux contaminants historiques a été corrélé à des défauts de reproduction, à l’apparition de cancer, et à la favorisation de maladies infectieuses qui peuvent conduire parfois à des évènements de mortalité de masse. Les principes actifs pharmaceutiques représentent une catégorie de contaminants d’intérêt croissant du fait de leur petite taille, de leur habileté à traverser les membranes, et de leur capacité à interagir avec les systèmes biologiques. L’étude de l’effet potentiel de leur combinaison entre eux ou à d’autres familles de composés en milieu aquatique en n'est qu'à ses premiers balbutiements. Mon travail de thèse se décompose en trois études ayant pour but l’évaluation de l’effet que des composés pharmaceutiques, seuls ou en combinaison, peuvent avoir sur le système immunitaire adaptatif des phoques communs (Phoca vitulina). Un ensemble de biomarqueurs a été utilisé pour évaluer la toxicité aigüe des principes actifs pharmaceutiques au niveau cellulaire ainsi que plus finement au niveau de l’expression de certains gènes. L’objectif principal était d’établir des courbes dose-réponse, ainsi que de déterminer la toxicité (IC50) pour les composés sélectionnés. La première étude consistait à évaluer de l’immunotoxicité de composés pharmaceutiques sur une lignée cellulaire dérivée d’un lymphome à cellules B de phoque commun. Des biomarqueurs comme la prolifération lymphoblastique, le cycle cellulaire et l’apoptose, ainsi que la viabilité ont été utilisés pour mesurer le niveau de toxicité de composés pharmaceutiques, seuls ou en combinaison. La prolifération lymphoblastique ainsi que le cycle cellulaire ont été affectés lors de l’utilisation de certains composés. Par ailleurs, les tests (à l'exception de celui de viabilité) ont révélé des effets synergiques lors du traitement avec des combinaisons de composés. La deuxième étude consistait à évaluer de l’immunotoxicité de composés pharmaceutiques sur des cultures primaires de lymphocytes T de chiots de phoques communs en liberté. Dans cette étude, la prolifération lymphocytaire a été inhibée alors que la viabilité est demeurée globalement inchangée lors de traitements avec les composés, seuls ou en combinaison. Les effets des combinaisons de composés n'ont pas été additifs. Les lymphocytes T étaient plus sensibles aux composés individuels que la lignée cellulaire dérivée d’un lymphome à cellules B, mais moins sensibles aux combinaisons. Lors de la troisième étude, nous voulu vérifier si le composé pharmaceutique le plus toxique lors des études précédentes (17α-ethinyl estradiol, EE2), à des concentrations inférieures, était capable d’interférer avec l’expression de certains gènes, dans le but d’identifier plus précisément les mécanismes de toxicité. Nous avons observé une toxicité sur la lignée cellulaire dérivée d’un lymphome à cellules B associée a une augmentation importante de l’expression de l’ARNm de la protéine de choc thermique de 70 kDa uniquement pour les concentrations entrainant des effets sur la prolifération et le cycle cellulaire. Dans son ensemble, ce travail a suggéré que le système immunitaire du phoque commun pouvait être affecté par l’exposition à des composés pharmaceutiques présents dans l’environnement, cependant à des concentrations supérieures à celles mesurées actuellement.

 Anthropogenic contamination of coastal regions and estuaries has consequences for the ecosystem’s health. Exposure to legacy contaminants in organisms of higher trophic levels has been linked to an impairment of reproduction, occurrence of cancer, and an increase in infectious diseases that even led to mass mortality events. Active pharmaceutical ingredients (APIs) are a contaminant class of emerging interest, since the molecules are rather small, penetrate membranes easily and were designed to interact with a biological system. Their potential effect in the cocktail of substances in the aquatic environment just begun to be discovered.During the course of this dissertation work, three studies were implemented to elucidate the effect that pharmaceuticals and pharmaceutical mixtures can have on the adaptive immune system of harbor seals (Phoca vitulina). A battery of biomarkers was used to assess the acute toxicity of APIs on the cellular as well as the gene expression level. The main objective was to determine dose-response curves and IC50 values for the selected compound list. In a first study, immunotoxicity of pharmaceuticals on a harbor seal B cell lymphoma cell line was assessed. Biomarkers like lymphocyte proliferation, cell cycle and apoptotic events as well as viability were used to determine the range of toxicity of individual pharmaceuticals and pharmaceutical mixtures. Both lymphocyte proliferation and the cell cycle were impacted by some of the individual compounds, and mixtures demonstrated synergistic effects in all assays, but the viability assay. In a second study, the immunotoxic effect of pharmaceuticals on T lymphocytes of free-ranging harbor seal pups was determined. Lymphocyte proliferation was inhibited while viability remained mainly unaffected for all individual compounds and mixtures tested. Mixtures had non-additive mixed effects. T lymphocytes were more sensitive to individual compounds than the B cell lymphoma cell line, but less sensitive to binary mixtures of pharmaceuticals than the cell line. In a third study, we wanted to assess if the most toxic pharmaceutical compound in our study (17α-ethinyl estradiol, EE2) would present toxic effects at lower concentrations at the gene expression level compared to the cellular level that was tested in previous studies, and furthermore discover potential mechanisms of action of the toxic response. We observed a toxicity towards the harbor seal B lymphoma cell line with a strong increase of the 70 kDa heat shock protein mRNA in those concentrations only that caused effects at the cellular level (i.e. lymphocyte proliferation and cell cycle changes). Overall this work suggests that the immune system of harbor seals can be affected by an exposure to pharmaceutical compounds, however at higher concentrations than currently found in the environment.