identifier: Guimond, Julien  (2007). Étude des systèmes de sécrétion Sec & Tat chez streptomyces lividans  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 166 p.

subject:
streptomyces lividans
secretion
système
precurseur
xylanase

abstract:
La voie de sécrétion Tat nouvellement étudiée, permet la sécrétion de  précurseurs déjà repliés dans  le  cytoplasme. Les précurseurs Tat  se  distinguent  par  la  présence d'une séquence consensus de 7 résidus d'acide aminé dans leur peptide signal. En recherchant ce motif  consensus,  le  programme  informatique  TatScan  prédit  129  substrats  Tat  chez Streptomyces  coelicolor.  Les sécrétomes de Streptomyces  lividans  sauvage, une proche parente de S. coe/icolor, et de son mutant du système Tat ont été étudiés pour vérifier la justesse de ces prédictions informatiques. Comme le sécrétome dépend des sources de carbone du milieu de culture, les bactéries ont été cultivées dans quatre milieux liquides avec une source de carbone différente, soit le xylose, le glucose, la chitine et un extrait de terre. Les protéines sécrétées ont été recueillies et séparées par électrophorèse sur gel en deux dimensions. Les protéines sécrétées par la bactérie sauvage mais absentes chez le mutant étaient vraisemblablement Tat et ont été analysées au spectre de masse. Les milieux xylose, glucose, chitine et terre ont permis d'identifier  respectivement 13, 14, 27 et 19 protéines candidates à  la  sécrétion par  le  système Tat pour  un  total  de  63  protéines différentes.  Parmi  celles-ci,  les  produits  des  gènes  SC00677,   SC01639,   SC02068, SC02780, SC02828, SC06005  et SC06131,  prédits par TatScan, sont confirmés pour la sécrétion Tat. Sept autres protéines, codées par les gènes SC01230, SC01860, SC02591, SC05260,  SC06109,  SC06199  et SC06590,  sont probablement Tat-dépendantes, mais possèdent un peptide signal qui  échappe à  l'analyse  de  tous  les outils  de  prédictions informatiques.  Les  protéines  codées  par  les  gènes  SC00494,   SC00638,   SC03967, SC05113, SC05420, SC05646, SC05776, SC06963  et SC07501  sont localisées dans la membrane et possèdent toutes un peptide signal ne correspondant pas à un peptide signal Tat. Les trois protéines codées par les gènes SC04622, SC02149 et SC05843 ne présentent aucun peptide signal et sont proposées comme candidates à la sécrétion par un mécanisme non conventionnel. Les 37  autres  protéines sont  cytoplasmiques, membranaires ou  de localisation inconnue et ne comportent pas de peptide signal.

Les protéines destinées à la sécrétion sont synthétisées sous la forme d'un  précurseur qui possède à son extrémité N-terminale une séquence appelée peptide signal qui est clivé lors de la sécrétion pour libérer la protéine mature. La majorité des précurseurs sont sécrétés par le système Sec, qui requiert que les précurseurs conservent une forme linéaire. Chez les bactéries à gram négatif, la chaperonne dédiée SecB permet à plusieurs précurseurs de conserver leur forme « dépliée » propre à la sécrétion Sec. Chez les bactéries à gram positif, aucun homologue fonctionnel de cette chaperonne n'a été découvert jusqu'ici. En purifiant le précurseur de la xylanase A2 de S. lividans,  une protéine Sec-dépendante, nous avons tenté de  co-purifier une chaperonne homologue à  SecB.  Pour ce  faire,  une étiquette d'histidines a été ajoutée à la xylanase A2, ce qui a permis la purification du précurseur de la xylanase A2 contenu dans la fraction cytoplasmique par chromatographie d'affinité sur colonne de sépharose-nickel. Une quinzaine de protéines accompagnaient le précurseur de la xylanase A2 et après analyse au spectre de masse, aucune ne présentait les caractéristiques d'une chaperonne éventuelle. Nous avons ensuite tenté de lier le précurseur à la chaperonne en utilisant des cross-linkers. La formation de liaisons réticulaires avec le DSP, le DSS et le GMBS suivi d'une chromatographie d'affinité sur colonne de sépharose nickel n'a pas permis de récupérer un complexe formé du précurseur de la xylanase A2 et d'une chaperonne. Parallèlement, la fraction membranaire a été testée pour la présence de complexes, mais sans succès. Finalement, nous émettons 1'hypothèse que la xylanase A2 puisse être sécrétée de façon co-traductionnelle, sans l'aide d'une chaperonne.

Comme les protéines sécrétées par le système Tat doivent être tout au moins partiellement repliées dans le cytoplasme, nous avons tenté de démontrer la présence d'une chaperonne qui favoriserait le repliement de la xylanase C de S. lividans, une protéine spécifiquement sécrétée par ce système. Comme pour la xylanase A2, la xylanase C a été munie d'une queue d'histidine permettant sa récupération sur colonne de sépharose-nickel. Les cross linkers DSP, DSS, GMBS et EDC ont été utilisés pour créer des liaisons réticulaires entre le précurseur de  la  xylanase C  et  sa  chaperonne et  ces  complexes ont  été  purifiés par chromatographie d'affinité  sur  colonne de  sépharose-nickel, sans  pouvoir  identifier la chaperonne. Une colonne d'immuno-affinité a été préparée pour tenter de récupérer ces complexes mais aucun des complexes récupérés ne contenait de xylanase C. Des complexes formés de  la  pré-xylanase C  et  de  sa  chaperonne ont  été  cherchés  dans  la  fraction membranaire  mais  seul  le  précurseur  a  été  retrouvé.  Finalement,  des  expériences préliminaires de  liaison avec le formaldéhyde, qui  forme des liens covalents avec les protéines, semblent faire apparaître des complexes dont les composantes n'ont  pas été analysées pour le moment.


identifier: Hardy, Pierre-Olivier  (2007). Translocation nucléaire de la PKC-a en répponse à l'IFN-y dans les macrophages : rôle de la p38 MAPK et de PI3K  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 97 p.

type:
Thèse
Non évalué par les pairs

subject: translocation nucleaire pkc alpha proteine kinase c interferon gamma macrophage

abstract:
L'activation   des  macrophages  est  une étape  clef  dans  l'établissement   de  leurs capacités microbicides pour la destruction d'un pathogène, l'élimination d'une cellule apoptotique et l'activation  de l'immunité adaptative. Cette stimulation est induite par des cytokines   pro-inflammatoires    telles   que   I'IFN-y   qui   modulent   plusieurs   réponses cellulaires par la stimulation de diverses voies de signalisation intracellulaires. Parmi ces intermédiaires,  certains  membres  de  la  famille  des  protéines  kinases  C  (PKC)  sont impliqués dans plusieurs réponses induites par cette cytokine. Notamment, la PKC-a est activée par l'IFN-y et module ultimement la transcription génique dans les macrophages. Par  ailleurs,  le  rôle  des  PKC  est  déterminé  par  leur  activation,  mais  aussi  par  leur localisation cellulaire. Ainsi, en réponse à l'IFN-y, la PKC-a transloque au noyau des macrophages   mais   ses   fonctions   nucléaires   et   les  mécanismes   requis   pour  cette translocation demeurent à identifier.

Durant ce projet, nous avons tenté de mieux caractériser la translocation nucléaire de   la  PKC-a.   Ainsi,   nous   avons   établi   l'implication    de   différentes   cascades   de signalisation  activées par I'IFN-y. Puis, nous avons caractérisé l'importance  de ces voies
pour l'expression  de gènes induits par I'IFN-y connus pour être modulés par la PKC-a. Enfin, nous avons établi un nouveau rôle pour la PKC-a dans la signalisation induite par I'IFN-y.

L'absence   d'un   signal  de  localisation   nucléaire  traditionnel  sur  la  molécule suggère  l'activation  de molécules de signalisation  et/ou  l'implication  d'un  transporteur requis pour la translocation de PKC-a. En utilisant une panoplie d'inhibiteurs pharmacologiques,   nous  avons  démontré  que  la  translocation  nucléaire  de  la  PKC-a requiert l'activité de la p38 MAPK et de la PB-K. Nous avons aussi déterminé que la translocation de la PKC-a est indépendante de sa propre activité ainsi que de celle de la protéine JAK.2 associée au récepteur de l'IFN-y.

À partir de ces résultats, nous avons déterminé que les mécanismes d'activation  de la MAPK p38 et de la PB-K sont indépendants et ne requièrent pas l'activité  de la JAK.2. De plus, ces cascades ne sont pas impliquées dans l'activation  de la PKC-a.

Enfin, nous avons établi que l'expression  de CIITA et du CMH II ne requiert pas la  translocation  nucléaire  de  la  PKC-a  puisque  leur  synthèse  n'est   pas  affectée  par l'inhibition de la p38 MAPK, mais implique l'activité  de PKC-a. L'activation de la PKC a est aussi requise pour la phosphorylation du résidu Ser727 du facteur de transcription STATI. En somme, nous avons déterminé que l 'IFN-y induit la translocation nucléaire de
PKC-a par l'intermédiaire de la MAPK p38 et de PI3K, mais cette translocation est indépendante de l'activité de la kinase, et n'est pas requise pour l'expression  de gènes précédemment définis comme dépendant de PKC-a.


identifier: Hébert, Caroline  (2005). Identification et caractérisation des allopeptides naturels reconnus par la cellule T 2.102  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 86 p.

subject: cellule t rejet greffe

abstract:
La réponse allogénique est caractérisée par une fréquence élevée de précurseurs de cellules T capables de reconnaître les molécules du CMH allogéniques. En effet, 1 à
1 0% des cellules T périphériques répondent aux alloantigènes, ce qui s'avère être un obstacle majeur aux transplantations. Il a été démontré que les peptides du soi associés aux molécules du CMH jouent un rôle crucial dans l'alloréactivité. Les progrès réalisés sur l'identification et la caractérisation de ces peptides ont jusqu'ici été principalement réalisés sur des systèmes impliquant des molécules du CMH 1. L'absence d'un système de CMH II soi/alloréactivité limite nos connaissances sur les mécanismes moléculaires d'interaction TCR-peptide-CMH du soi vs TCR-peptide-CMH alloréactif.

Un modèle d'étude du rejet de greffe utilisant diverses souris transgéniques a donc été mis au point dans notre laboratoire. Dans ce cadre, notre modèle CMH II est basé sur le clone de cellule T CD4+ 2.102. Ce clone est spécifique au peptide de l'hémoglobine Hb(64-76) lorsque présenté par une molécule du CMH II I-Ek du soi. La cellule T 2.102 est également alloréactive contre la molécule du CMH II l-EP où le ou les peptides naturels présentés ne sont pas encore connus. L'objectif de ce projet est d'identifier et de caractériser ces peptides naturels à l'aide d'une purification des molécules du CMH II par chromatographie d'affinité et la caractérisation des peptides associés aux molécules.

Les  complexes  CMH  II  l-EP/peptide ont  été  purifiés  par  chromatographie d'affinité à partir de la lignée cellulaire CH27-EP-EPM. Cette lignée cellulaire exprime constitutivement les complexes CMH II l-EP/peptide EPM. Le peptide EPM, généré suite au criblage d'une banque peptidique combinatoire, a été utilisé pour valider la méthode. Une fois les complexes CMH II l-EP/peptide purifiés, les peptides ont été dissociés des molécules du CMH II par traitement acide puis séparés par HPLC. Nous avons démontré que certaines fractions d'HPLC peuvent reconstituer l'alloréactivité de la cellule T 2.102. En particulier, les fractions obtenues à 50,5, 58 et 64 minutes sont celles capables de stimuler  le  plus  fortement  la  cellule  T  2.102. Ces  fractions  ont  été  analysées  par spectrométrie de masse. Deux peptides ont été identifiés dans les fractions à 50,5 min et 64 min. Le premier correspond aux 13 acides aminés de l'épitope  EPM. Le second peptide correspond aux 13 acides aminés de l'épitope EPM additionné d'une glycine et d'une sérine à l'extrémité C-terminale. Ces deux derniers résidus proviennent des acides aminés encodés dans la cassette d'expression du vecteur utilisé pour la transfection des cellules CH27-EP-EPM. Les expériences pourront être effectuées avec la lignée cellulaire CH27-EP afin d'identifier et de caractériser les peptides naturels capables de reconstituer l'alloréactivité de la cellule T 2.102.


identifier: Hupé, Jean-François  (2008). Enrichissement et recherche de certaines activités enzymatiques produites par des bactéries aérobies thermophiles  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 161 p.

subject: enzyme lipide

abstract:
Les enzymes thermophiles présentent plusieurs avantages par rapport aux enzymes mésophiles, notamment à cause de leur plus grande résistance à la dénaturation thermique et chimique. La demande en thermozymes pour des applications biotechnologiques est en forte croissance.  Les lipases, les estérases,  les amylases,  les cellulases  et les protéases sont les enzymes thermophiles les plus recherchées dans divers secteurs industriels.

La prémisse de ce projet était que les bactéries aérobies thermophiles ont la capacité de produire des enzymes thermostables originales d'intérêt  industriel. Un premier objectif de ce  projet  était  l'enrichissement  de  bactéries  aérobies  thermophiles   en  fonction   de différentes sources de carbone. Neuf enrichissements différents ont été réalisés où les substrats  utilisés comprenaient  un extrait de viande, du son de blé, de la lignine, de la chitine, de la gélatine, un mélange d'huiles de canota et de palme et un mélange d'huile d'olive et de Tween 80. Ces divers enrichissements  avaient comme objectif de stimuler l'implantation d'une  biomasse spécialisée dans la dégradation de chaque substrat. Les microflores ont été enrichies dans des conditions  aérobies thermophiles  (50-70°C) et de pH alcalins (7,0-8,5). Le suivi de l'évolution de la diversité bactérienne dans le temps par PCR-DGGE du gène codant pour 1'ARN ribosomal 16S a permis de constater que, globalement, les microflores résultantes des divers enrichissements  sont différentes selon la source de carbone employée.

Pour le présent projet, une attention particulière  a été portée s r la recherche d'activités Iipolytiques, plus spécifiquement de type lipase. Les biomasses enrichies en présence de lipides ont servi à la recherche d'enzymes Iipolytiques via une approche classique d'isolement de bactéries productrices d'enzymes, alors que les biomasses provenant des autres  enrichissements   ont  été  utilisées  dans  un  autre  projet  visant  la  recherche  de différentes thermozymes par une approche métagénomique.

Des microflores enrichies en présence de lipides, 34 souches bactériennes ont été isolées et caractérisées. Selon leur profil obtenu par PCR-DGGE de leur gène codant pour l'ARN ribosomal 16S, les souches ont été réparties en dix groupes. Le séquençage  de ce même gène  a  pe1mis de  faire  l'affiliation  la  plus  probable  des  souches  avec  des  espèces connues.  La grande  majorité  des souches sont affiliées  à la famille  des Bacillaceae,  la plupart appartenant au genre Geobacillus. Deux souches originales, F12-TH0-01 et F12- TH0-02, ont  été isolées  du  mini-fermenteur  enrichi  en  présence  d'huile  d'olive  et de Tween 80. Selon les analyses phylogénétiques,  les espèces connues les plus rapprochées sont respectivement Bacillus thermoamylovorans (93-94% d'identité) et Chelatoccocus asaccharovorans  (95% d'identité) ce qui suggère qu'elles pourraient représenter deux nouvelles espèces bactériennes jamais décrites.

Le potentiel enzymatique des souches isolées a été évalué pour produire 19 activités différentes  par  des  galeries   API  ZYM  incubées  à  60°C.  La  majorité  des  souches exprimaient des activités phosphatase alcaline, estérase (C4), estérase-lipase (C8) et a glucosidase d'une  bonne intensité. L'activité  lipase (C14) était beaucoup moins détectée auprès  des  souches  testées.  Les  souches  ont  ensuite  été  criblées  pour  une  activité lipolytique sur milieux solides via la méthode de précipitation au calcium et la méthode à la Rhodamine B. L'utilisation  de l'huile d'olive  comme substrat dans la méthode à la Rhodamine B suggérait la détection d'activité lipolytique de type lipase pour la majorité des souches testées.

La  caractérisation  préliminaire  des  activités  lipolytiques  des  souches  F12-TH0-01  et F12-RT-091  à partir de surnageants  de culture a permis d'identifier des activités de type estérase  plutôt que lipase.  Dans les deux cas, l'activité estérase  était  thermophile  (55-
60°C), alcaline (supérieure à pH 8,5 qu'à  7,5) et sensible à la présence de Triton X-100 où on observait respectivement des pertes de 50% et 35% d'activité en présence de 0,5% de Triton. La caractérisation  des autres souches isolées pourrait éventuellement  révéler la
présence de nouvelles thermozymes ayant des activités lipolytiques intéressantes pour des applications industrielles.


identifier: Hyjazie, Huda  (2011). Factors involved in alternative polyadenylation during herpes simplex virus 1 infection  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 101 p.

subject: hsv-1

abstract:
The symbols and special characters used in the original abstract could not be transcribed due to technical problems. Please use the PDF version to read the abstract. Herpes simplex virus 1(HSV-1} is an important human pathogen that infects more than 80% of the population and causes serious disease in immunocompromised individuals and newborns. This virus has a dense DNA genome that codes for more than 80 genes, thus necessitating effective genetic regulation. One of the modes of regulation utilized by HSV-1is alternative polyadenylation: a post-transcriptional event that allows one gene to use two different polyadenylation signais (PAS}. This process generates transcripts that differ in their 3' untranslated region (3'UTR}, which can affect translation efficiency among ether things. Severa! HSV-1genes including UL24 and UL38 are regulated by alternative polyadenylation. UL24 short transcripts, which arise from the use of the UL24 polyadenylation signal, are expressed with early kinetics, while UL24 long transcripts, which arise from use of the UL26 polyadenylation signal, are expressed with late kinetics.

We hypothesized that the switch in PAS usage is due to changes in the steady-levels of polyadenylation factors over the course of infection. We aIso hypothesized that the degree of association of the polyadenylation factors with the different polyadenylation sites changes over the course of the infection.

ln order to test the first hypothesis, Vero and Hela cells were either mock-infected or infected for 3, 6, 9,12 and 16hrs,and cell lysates were prepared. We evaluated the steady-state levels of three subunits of polyadenylation factors,CPSF-100,CstF-64 and CFIm-25,by Western blot. We did not observe any reproducible change in the levels of these factors for the first 12 hours of infection, and therefore, a change in their levels could not explain the shift in PAS usage of the alternatively polyadenylated UL24 gene observed at around 10hpi. Severa subunits could not be evaluated using this technique  due to commercial antibody  availability and specificity.
Nevertheless, though we did not observe a reproducible change in the steady-state levels of the factors tested during the first 12 hours of infection, we cannot rule out the possibility that the localization and the RNA or protein interactions of the various factors or subunits may have
been affected.

To test the second hypothesis, we had as an objective to identify proteins that interact  with the
3'UTRs of alternatively polyadenylated transcripts  during the infection. To identify these proteins,we developed an affinity purification system based on the S1RNA aptamer. We evaluated lysates from mock-infected cells as weil as cells infected for Shrs and 10hrs. Bound
proteins  were analysed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS}. Among other proteins, we identified eEFlA and NF45, both nuleic acid binding proteins. eEFlA plays a rote in translation fidelity and also assists in the nuclear export of mature tRNA, and NF45 is a transcriptional activator. These results serve as proof  of principal for this strategy to identify proteins  that interact  with the 3'UTR of viral transcripts. Future work will be aimed at validating the proteins identified, and investigating other possible mechanisms involved  in alternative polyadenylation such as post-translational modifications of polyadenylation factors. The results from this project  will contribute to a better  understanding of genetic regulation by alternative polyadenylation.


identifier: Imbeau, Marianne  (2011). Identification des sources de contamination fécale dans les eaux de surface par détection de l'adn mitochondrial comme marqueur spécifique d'espèce  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 155 p.

subject:
riviere assomption
south nation
pcr

abstract:
La contamination fécale humaine et animale des eaux de surface a des impacts considérables sur l'environnement et la santé publique. En effet, l'utilisation récréative ou domestique de cette eau favorise le contact entre la population et les microorganismes fécaux potentiellement pathogènes, allant jusqu'à provoquer 1'éclosion de maladies infectieuses. Plusieurs situations peuvent causer ce type de contamination et le problème peut s'avérer très complexe dans un grand bassin versant. Pour être en mesure d'élaborer des stratégies de réhabilitation des cours d'eau  problématiques, les gestionnaires et les scientifiques ont besoin d'un outil de détection spécifique leur permettant d'identifier directement l'espèce animale qui est à l'origine de la contamination et, indirectement, de cibler l'activité qui cause la contamination.

Ce projet proposait de mettre au point une méthodologie d'amplification  nPCR à haut débit permettant le suivi des marqueurs mitochondriaux pour plusieurs espèces animales et de l'appliquer à l'étude des sources de contamination fécale dans des bassins versants dont la contamination est récurrente. Il se basait sur des études antérieures ayant démontré que  la  détection  d'ADN  mitochondrial dans  l'eau  est  assez  spécifique  et sensible pour qu'il soit utilisé comme indicateur de la source d'une contamination fécale.

Tout d'abord, un protocole d'amplification nPCR qualitative en temps réel a été développé et optimisé pour détecter spécifiquement les marqueurs mitochondriaux de 14 espèces animales susceptibles d'être à la source d'une contamination fécale. La validation effectuée à l'aide d'ADN total extrait de tissus animaux a présenté d'excellents résultats de spécificité et de sensibilité d'amplification. L'application de ce protocole à l'analyse d'eaux  usées a permis d'y  détecter la présence d'ADNmt  mitochondrial d'humain,  de porc, de bœuf, et de cheval.

En parallèle, des échantillons d'eau de surface du bassin versant de la rivière l'Assomption (Québec) ont été prélevés pour effectuer le décompte des coliformes thermotolérants  et  en  extraire  l'ADN   total.  Une  collaboration  avec  Agriculture  et Agroalimentaire  Canada a aussi permis l'accès  à une série d'échantillons d'ADN extrait des eaux de surface du bassin versant de la rivière South Nation (Ontario). Les résultats issus de   1'analyse des échantillons de ces deux bassins versants   indiquent une prédominance des marqueurs mitochondriaux   humains   quoique  cinq  autres  espèces d'élevage y aient parfois été détectées. L'occurrence de marqueurs mitochondriaux  dans les eaux de surface n'a  toutefois  pas présenté  de réelle continuité entre les réplicats ou entre les sites d'échantillonnages situés en amont et en aval d'un même cours d'eau.

Finalement, une méthodologie alternative a été développée  pour permettre l'éventuelle adaptation du protocole de  détection à une plateforme robotique. Sa validation et son  application à l'analyse d'un échantillon d'eaux usées a permis d'en démontrer l'efficacité pour la détection de 11 des 14 espèces ciblées. Cette approche n'a toutefois pas pu être appliquée à la détection de 3 des 14 espèces en raison des structures secondaires formées par les paires    d'amorces spécifiques correspondantes. La robotisation des analyses minimiserait le coût des réactifs et de la main d'œuvre tout en maximisant le débit, ce qui serait  favorable à l'adoption à grande échelle de l'ADNmt comme marqueur spécifique d'espèce pour identifier les sources de contamination fécale dans les eaux de surface.


identifier: Isabelle, Martine  (2007). Isolement et caractérisation de bactéries capables de métaboliser les estrogènes dans le lisier de porcs  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 105 p.

subject: Estrogene lisier porc bacterie methylobacterium ochrobactrum pseudomonas mycobacterium degradation biodegradation

abstract:
La transcription des symboles et des caractères spéciaux utilisés dans la version originale de ce résumé n’a pas été possible en raison de limitations techniques. La version correcte de ce résumé peut être lue en PDF.L'objectif principal de ce projet de maîtrise était d'isoler et de caractériser des  bactéries  capables  de  métaboliser  les estrogènes   présents  dans  le  lisier  de porcs. Ces hormones, excrétées par le porc, peuvent agir comme perturbateurs endocriniens   et  causer   différents   effets   biologiques   néfastes   chez   plusieurs espèces animales. Il est donc pertinent d'investiguer plus en profondeur leur biodégradation  et les microorganismes qui en sont  responsables.  Au cours de ce projet,  une méthode  sensible  et  reproductible  de détection  des  estrogènes  a été mise au point grâce à l'utilisation de la spectrométrie  de masse en tandem.  Un consortium  bactérien a été enrichi, à partir de la biomasse tirée d'un  biotraitement du 1 isier de porcs, en présence d'une faible concentration  ( 1   mg/L) de -estradiol ( E2), d 'estrone  (E1) et d'équol   (EQO),  les trois estrogènes  les  plus abondants dans le lisier de porcs. Le consortium obtenu est capable de dégrader  efficacement ces trois composés et nous avons montré que ce n'est pas la monooxygénase de l'ammoniac   des  bactéries  nitrifiantes  qui  est  responsable  de  cette  dégradation. Nos   travaux   ont   mis   en   évidence   cinq   souches   bactériennes    capables   de métaboliser     les    estrogènes,     affiliées    à    quatre    genres     bactériens,     soit
Methylobacterium  (MI6.1 R),  Ochrobactrum (MI6.1 B  et  Ml9.3),  Pseudomonas (MII4.1) et  Mycobacterium  (MI21.2).   Les souches   Ml9.3,   Mll4.1  et  Ml21.2 dégradent  le  BE2 et  l'El, alors  que  MI6.1B  transforme  seulement  le  BE2. Une réaction  inhabituelle  par l'isolat  MI6.1 R a été observée,  soit la réduction  de I'E1 en	BE2 en  conditions   aérobies.   Normalement,   c'est   la  réaction inverse   qui survient,  soit  l'oxydation du  BE2 en E1. Une expérience  avec  des  analogues  de
1' E1   a  montré  que   la  réduction   de  la  fonction   cétone   par  cette  souche   est relativement  spécifique. Finalement,  les résultats  obtenus  montrent  que  l'activité
de transformation  de  BE2 et de E1  par toutes les souches isolées est constitutive  et
suggèrent qu 'elle serait le résultat de réactions de co-métabolisme.


identifier: Jean, Myriam  (2010). Évaluation du potentiel thérapeutique des nanocomplexes pVax-GLP-1/chitosane et de siARN-DPP4/chitosane pour le contrôle du diabète de type 2  Thèse.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en biologie, 256 p.

subject: therapie gene

abstract:
Le diabète de type 2 est une maladie métabolique qui se caractérise par une hyperglycémie  chimique. Selon l'Organisation mondiale de la santé (OMS),  plus de 300 millions  de personnes  seront  atteintes  du diabète  d'ici  l'an  2025  et cette augmentation concerne   essentiellement    le   diabète   de   type   2.   Devant   l'accroissement   alarmant d'individus atteints du diabète de type 2, il s'avère très important d'explorer de nouvelles avenues  pour la mise au point de traitements,  nouvelle  génération,  plus efficaces  pour réduire les symptômes, les complications et la mortalité associée au diabète de type 2.

Le GLP-1  (glucagon-like  peptide 1) est un dérivé du proglucagon  qui stimule  la sécrétion de l'insuline et inhibe la sécrétion du glucagon, une hormone antagoniste de l'insuline. Pour normaliser  les concentrations  de glucose chez les personnes  atteintes du diabète  de  type  2,  le  GLP-1  doit  être  administré   de  façon  continue   afin  d'éviter l'inactivation  rapide de ce dernier par l'enzyme dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV).  Notre projet de recherche consistait donc à développer et à évaluer le potentiel d'une thérapie génique,  dont  le principe consiste  à transférer  le gène qui exprime  la molécule  GLP-1 pour  traiter  le  diabète  en  utilisant  le  vecteur  d'expression  recombinant  pVax-GLP-1 combiné à un polymère à base de  chitosane comme système de livraison.

Le chitosane est un polysaccharide naturel et biodégradable dont   les propriétés biologiques sont définies par sa masse molaire moyenne (Mn) ainsi que par sen degré de désacétylation (DD) qui correspond à la fraction monomère glucosamine du polymère. Le chitosane forme instantanément  des nanocomplexes• avec l'ADN  et l'ARN  par attraction électrostatique  en  condensant  les  acides  nucléiques.  Le ratio  N:P correspond  au  ratio amide de chitosane: phosphate de l'ADN.  Ainsi le plasmide recombinant  pVax-GLP-1 (7-37)  exprimant  la  forme  active  du  GLP-1,  soit  le  GLP-1  (7-37),  et  les  plasmides
recombinants exprimant les formes variantes du GLP-1 (7-37) soit le [Ser8-GLP-1  (7-37)] et le  [Tyr9-GLP-1  (7-37)], modifiées pour accroître leur résistance à la dégradation par la DPP-IV et augmenter leur demie vie biologique, ont été complexés avec trois différentes
formulations  de chitosanes  soit le   [92-10-5,  80-10-10  et 80-80-5  (DD-Mn-N :P)]  pour créer six nanocomplexes  thérapeutiques  pVax-GLP-1/chitosane  (NCT). Ces formulations de   chitosane   ont   été   choisies   en   fonction   de   leurs  propriétés   inflammatoires   et biodégradables (Jean et al., 2009).

Nous nous sommes intéressés à l'évaluation de l'efficacité de transfection et d'expression de gènes recombinants, en utilisant des nanocomplexes  composés des trois formulations de chitosane, in vitro, dans trois lignées cellulaires (les cellules hépatocytes HepG2  et  les  cellules  du  colon   HT-29  et  Caco-2).  Nous  avons  démontré   que  la transfection des lignées cellulaires avec les nanocomplexes codant pour la luciférase et la
-galactosidase a permis une augmentation  de l'expression  des gènes  recombinant dans les  cellules  HepG2  (1,2  x 107   RLU/min*mg  de  protéine)  et  dans  les  cellules  Caco-2 (1,7x107  RLU/min*mg  de proté ne) relativement aux cellules traitées avec les plasmides recombinants seuls. Les tests de viabilité effectués sur les cellules HepG2, Caco-2 et HT-

29 transfectées avec les nanocomplexes pEGFPLu/chitosane ont montré que le chitosane n'a pas d'effet  toxique sur les cellules in vitro.

Les analyses en microscopie électronique et par diffusion dynamique de la lumière (OLS) ont démontré que les NCT pVax-G LP-1/chitosane ont une forme principalement sphérique, un diamètre variant entre 163 à 246 nm et un potentiel zêta variant de 26 rn V à
32 rnV. Nous avons également démontré que le chitosane protège plus de 70% de l'ADN
recombinant contre la dégradation par des concentrations élevées de DNase 1 (2 unités/11g d'ADN). Les analyses en microscopie  confocale des cellules  transfectées avec les NTC ont démontré que les nanocomplexes sont internalisés dans les HepG2, 4 heures suivant leur ajout sur les cellules. Toutefois seuls NCT composés du chitosane 92-10-5, relâche la totalité du pVax-GLP-1 à l'intérieur des cellules 24 heures suivant la transfection. La quantification  de  l'expression   du  peptide  GLP-1  dans  les cellules  HepG2  transfectées avec les NCT a montré que les NCT composés du chitosane 92-10-5 permettent une expression  plus importante du GLP-1  et de ses formes variantes (30 à 120 ng/L) que les NCT  composés  des  chitosanes  80-10-10  et  80-80-5  {10-60  ng/L).  L'expression   des formes variantes du GLP-1 était 4 fois plus élevée que celle du GLP-1  natif, confirmant leur protection contre la dégradation  par l'enzyme  DPP-IV. Nos résultats suggèrent que, in vitro, le chitosane n'est  pas toxique et représente un système de livraison efficace et sécuritaire   du   plasmide   recombinant   pVax-GLP-1   permettant  ainsi   une  expression continue du GLP-1.

Dans un deuxième temps, nous avons évalué l'expression  du GLP-1  et son effet sur la tolérance au glucose, in vivo, en utilisant un modèle animal diabétique (rats ZDF). Nous avons montré que l'administration des NCT aux rats diabétiques ZDF induit une augmentation  de  l'expression   du  GLP-1  d'une  manière  continue  (35  pmol/L),  ce qui confère une tolérance au glucose 2 fois plus importante que celle observée chez les rats ZDF non traités et ce, durant 29 jours suivants la fin du traitement. Ceci a été confirmé par 1 'évaluation  du taux d'insuline chez les rats qui passe de 5 ng/ml à 12 ng/ml suivant le traitement avec les NCT et par 1 'évaluation  de la prise de poids qui diminue de 5% chez les rats traités avec les NCT comparativement  aux rats injectés avec le pVax seul. Par ailleurs, les études histologiques nous ont permis d'évaluer  d'une  part, le potentiel inflammatoire  de  chacun  des  NCT  et d'autre   part,  leur cinétique  de  biodégradabilité. Ainsi,  les  NTC  pVax-GLP-1/92-1 0-5,  suite  à leur  administration,  se  sont  avérés  peu inflammatoires  et leur dégradation  était  complétée  en environ  1  jour comparativement aux NCT pVax-GLP-1180-10-10 et 80-80-5. Ces derniers étaient moins biodégradables et ont  suscité  une  plus  grande  mobilisation  des  leucocytes  aux  sites  d'injections. Ces résultats  révèlent, pour  la première  fois, que  les NTC composés  du chitosane  92-10-5 seraient les candidats potentiels pour livrer de façon continue, in vivo, la protéine recombinante  GLP-1  à des fins thérapeutiques  tout en évitant  une réponse immunitaire qui pourrait être néfaste pour l'organisme et nuisible pour le traitement du diabète de type
2.

Parallèlement, nous avons développé d'autres  NCT composés d 'ARN interférents (siARN)   dirigés  contre  I'ARNm   du  gène  DPP-IV  et  complexés  aux  3  différentes formulations de chitosane soit le  92-10-5, 80-10-10 ou 80-80-5 (% DO, Mn, ratio N : P). Ces NCT (siARN-DPP4/chitosane) ont été conçus afin de diminuer l'expression  in vitro

de la DPP-IV responsable de la dégradation du GLP-1. Les analyses par microscopie électronique et par diffusion dynamique de la lumière (OLS) ont démontré que les nanocomplexes ODN-DPP4/chitosane  produits sont sphériques et homogènes, ils ont un diamètre de 71 à Ill nm et un potentiel zêta variant de 16 mV à 20 mV. Des analyses, in vitro, des cellules HepG2 transfectées avec les nanocomplexes  ODN-DPP4/chitosane, en microscopie confocale ont démontrées que les nanocomplexes ODN-DPP4/chitosane sont intemalisés 1 heure suite à la transfection des cellules alors que les ODN sont relâchés du chitosane à partir de 2 jusqu'à 30 heures suivant la transfection.

Nous avons également démontré, par des tests enzymatiques,  que l'utilisation  de NCT (siARN-DPP4/chitosane) permet de réduire jusqu'à  50% l'expression  de l'enzyme DPP-IV dans les cellules HepG2 et Caco-2. Ces résultats, ont été confirmés par la quantification du niveau d'expression  de la DPP-IV par qRT-PCR et qui a montré que la transfection des cellules HepG2 avec les NCT (siARN-DPP4/chitosane) entraîne une inhibition de l'expression  du gène DPP-IV de l'ordre de 65%.

En  conclusion,  au  cours  de  ce  projet nous  avons  mis au  point  et ce,  pour  la première fois, des NCT (pVax-GLP-IIchitosane) qui expriment le GLP-1 sous sa forme active qui agit en stimulant  la sécrétion d'insuline,  en diminuant la prise de poids et en conférant   une  meilleure  tolérance  au  glucose  chez  les  rats  diabétiques.  Ces  NCT constituent  un matériel  novateur  très important  dans  le développement  d'une  thérapie génique  pour  le  traitement  efficace  du  diabète  de  type  2.  Parallèlement,  nous  avons démontré le potentiel des NCT (siARN-DPP4/chitosane) capable de réduire, in vitro, l'expression  de  l'enzyme  DPP-IV  responsable  de  l'inactivation  du  GLP-1.  Ainsi, nos travaux montrent le potentiel des NTC pVax-GLP-1/chitosane  qui pourront être utilisés en  thérapie  génique  seuls  ou  combinés  aux  NCT  (siARN-DPP4/chitosane)   pour  le traitement du diabète de type 2.


identifier: Jones, Steven R.  (2010). Regulation and characterization of the ATP-binding cassette transporter-B1 in the epididymis and epididymal spermatozoa of the rat  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en sciences expérimentales de la santé, 118 p.

subject:
epididyme
spermatozoïde
pollution
alkyphenol toxicologie
transporteur
abc

abstract:
The epididymis and maturing spermatozoa are susceptible   to the effects of xenobiotics. A functional blood-epididymis barrier (BEB)attenuates the entry and facilitates the elimination of potentially harmful   substances from the epididymal epithelium. ln addition to providing a sophisticated immunological barrier, the BEB barrier provides a specialized, protected environment where sperm transit, are concentrated and acquire  both  motility and the ability  to fertilize.  The BEB is composed of  both tight junctions and specialized transporters capable of regulating the types and quantities of compounds entering the epididymal lumen.

Recent evidence suggests that oral administration of alkylphenols (AP), wh ile being able to reach the testis and epididymis, fait to accumulate in these tissues. This suggested that these tissues could either rapidly  metabolize  AP or expulse them from the cells. Severa specialized efflux transporters that function to exclude xenobiotics from target cells have been identified. ABCBl   is a broad specificity ATP-binding cassette (ABC) transporter capable of excluding xenobiotics out of cancerous and normal tissues serving barrier or secretory function.

Little is known about the role of ABC xenobiotic efflux  transporters in the epididmyis. The objectives of this study were to characterize the expression profile and functional rote of ABCBla and ABCB1 b along the different regions (initial segment, caput, corpus, cauda) of the rat epididymis.

ABCB1a and ABCB b transcripts were detected in ali regions of the epididymis. Immunohistochemistry conducted with an antibody that recognizes both forms of rodent ABCB l  revealed a unique expression gradient in both the  epididymal epithelium and epididymal spermatozoa along the length of the tissue. Little to no staining was present on the sperm present in the lumen or epithelium in  proximal  regions of the epididymis, whereas a strong  immunoreaction was observed in distal caput, corpus and cauda. Expression gradients in the tissue and epididymal spermatozoa were confirmed by western blot. These results suggested an important role for ABCBl in epididymal tissue defense and spennatozoal protection, as weil as a unique process where spem1 acquire ABCB1 protein during epididymal transit.

ABCBl functionality in epididymal principal cells and epididymal spennatozoa was confinned  using a multi drug resistance (MOR) assay. A rat principal cell line (RCE) and epididymal spennatozoa exctracted from proximal and distal regions of the epididymis demonstrated an inhibitable MDR  phenotype  when incubated with calcein, an ABCBl substrate, in the presence of specifie ABCBl inhibitors.

Lastly, to assess whether or not the system was inducible by xenobiotics, RCE cells were exposed to various  concentrations of nonylphenol (NP), an AP,and  doxorubicin (DOX),an an ti-cancer agent and known inducer of ABCB1. RCE cells exposed to NP and DOX revealed a significant induction of ABCB la and ABCB lb mRNA, as weil ABCB l protein, suggesting the existence of a dynamic defense mechanism that can respond to chemical insult.

The unique expression profile and induction of ABCBl in epididymis suggests a role in regulating epididymal barrier function and protection of spennatozoa.  ABCB l may be  an  important  toxicokinetic  regulator of AP and  other  xenobiotics in the adult rat epididymis.


identifier: Khosravi, Roozbeh  (2008). Maladies parodontales et obésité chez les enfants  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en sciences expérimentales de la santé, 87 p.

subject: gingivite parodontite

abstract:
La transcription des symboles et des caractères spéciaux utilisés dans la version originale de ce résumé n’a pas été possible en raison de limitations techniques. La version correcte de ce résumé peut être lue en PDF.
Plusieurs  études  ont  démontré  une  association  entre  l'obésité,  le  diabète,  les maladies cardiovasculaires et les maladies parodontales chez les adultes (1). Malheureusement, les mécanismes biologiques potentiels derrière ces associations demeurent inconnus. Néanmoins, l'augmentation  des adipokines (e.g., TNF-a) produites  par  le  tissu  adipeux  suggère  une  présence  de  mécanismes inflammatoires semblables dans la pathophysiologie de ces maladies (2, 3). L'objectif  de  la  présente  étude  est  d'investiguer   la  possibilité  que  l'adiposité mesurée à l'aide de l'indice de masse corporelle (IMC) soit associée à la concentration  de TNF-a  dans le liquide créviculaire (LC) chez les enfants. De plus, nous désirons déterminer si cette relation est modulée par l'insuline  à jeun (l'indicateur  de  la  résistance  à  l'insuline).  Cette  étude  transversale  utilise  des données préliminaires de l'étude cohorte QUALITY qui consiste en une étude longitudinale en cours concernant l'histoire naturelle de l'obésité chez des enfants québécois. L'échantillon  consiste en 76 filles et 102 garçons âgés entre 8 à 10 ans qui présentent un risque d'obésité  et qui demeurent dans les régions de Montréal et de la ville de Québec. Des échantillons de LC ont été prélevés à 1'aide de PerioPaper®. Le Periotron 6000® a été utilisé afin de déterminer le volume de chaque échantillon. Les concentrations de TNF-a ont été mesurées à partir d'échantillons  combinés (N=4) pour chacun des enfants avec la méthode ELISA (RampD  systems).  La  taille  et le  poids ont  été  mesurés  à l'aide  de  procédures
standardisées. L'IMC  a été déterminé à partir de l'équation suivante: poids/taille2

(kg/m2  . L'IMC  spécifique à l'âge et au sexe à été divisé en trois catégories, soit normal (premier 85% des valeurs IMC), surpoids (tranche de 85-95%) et obèse (supérieur à 95% des valeurs de l'IMC). Ces défmitions proviennent des courbes de croissance du US-CDC pour l'année  2000. L'insuline  à jeun a été mesurée à partir  d'échantillons   sanguins  des  enfants.  L'analyse   des  données  inclut  les analyses  descriptives  et  la  régression  linéaire.  Nos  résultats  suggèrent  que l'obésité chez les garçons est associée à une augmentation de 37% des valeurs de
TNF-a. Cette association a été considérablement atténuée lorsqu'on a inclut les valeurs d'insuline plasmatique dans le modèle. Ceci suggère possiblement un rôle modulateur de  l'insuline  plasmatique. Ces  données  supportent  le  lien  entre
1'adiposité chez les enfants •et les concentrations de TNF-a. dans le LC.


identifier: Kortbaoui, Randa  (2008). Identifacation de la source de contamination fécale dans l'eau par la détection de l'ADN mitochondrial  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 103 p.

subject: technique pcr eau bacterie virus microorganisme parasite

abstract: L'objectif  de ce projet de recherche débuté en 2005 était d'optimiser  une nouvelle méthode moléculaire capable d'identifier  les sources de pollution fécale humaine et animale dans l'eau. À l'opposé de nombreuses approches déjà expérimentées qui détectent des microorganismes indicateurs ou des virus et des protozoaires associés à certaines espèces, la méthode proposée ici cible un marqueur génétique des cellules humaines et animales excrété via les fèces. L'ADN mitochondrial a été choisi comme cible compte tenu des différents avantages  qu'il   possède:  sa  présence  en  plusieurs  copies  dans  la  cellule,  sa  structure circulaire, sa durée de vie, etc.   Pour ce faire, un protocole d'amplification par PCR et PCR interne a été élaboré avec des amorces ciblant spécifiquement les ADNs mitochondriaux humain, ovin, bovin, porcin et de poulet. Ces amorces spécifiques ont ensuite été testées avec les ADNs extraits d'eaux  usées provenant de  la station  d'épuration  de  Fabreville,  de  la station d'épuration d'Auteuil ainsi sur les eaux des rivières de l'Assomption et des Mille-Îles. Le protocole d'échantillonnage  a été simplifié en passant par une étape de filtration suivie d'une extraction rapide de l'ADN total par broyage avec des billes de verre. La contamination fécale de l'eau a été déterminée dans certaines rivières et plusieurs espèces ont été détectées dans  les échantillons d'eaux  usées. Il a été démontré  que  le PCR interne est capable  de détecter   plus  d'espèces   que  le  PCR  simple.  Des  amorces   universelles  ont  aussi   été développées pour cibler les cinq espèces en même temps. Ces amorces ont permis en une seule réaction de PCR d'amplifier l'ADN mitochondrial présent dans l'eau. La discrimination des espèces a été faite par des expériences de dot blot. Pour ce faire, des oligonucleotides spécifiques à chaque espèce ont été fixés sur des membranes de nylon. Le produit de PCR (préalablement  marqué) a servi de sonde  pour une hybridation avec ces oligonucléotides. Une  analyse  comparative  entre  la  technique  dot  blot  et  celle  du  PCR  avec  amorces spécifiques  a  révélé  les mêmes  résultats sur  les échantillons  d'eau.  En conclusion,  cette méthode est simple, rapide, fiable et efficace pour identifier la source de la contamination fécale dans l'eau.


identifier: Labbé, Normand  (2007). Caractérisation du dynamisme microbien du dénitrificateur marin du Biodôme de Montréal  Thèse.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en biologie, 142 p.

subject: denitrification biodome montréal nitrate denitrificateur bacterie biofilm

abstract:
La transcription des symboles et des caractères spéciaux utilisés dans la version originale de ce résumé n’a pas été possible en raison de limitations techniques. La version correcte de ce résumé peut être lue en PDF.La transcription des symboles et des caractères spéciaux utilisés dans la version originale de ce résumé n’a pas été possible en raison de limitations techniques. La version correcte de ce résumé peut être lue en PDF.Dans les aquariums, le taux de nitrate augmente rapidement au-delà de 50 mg-N-N03/L. Le Saint-Laurent  Marin  du  Biodôme  de Montréal  n'échappe  pas à cette accumulation malgré un important système de traitement de l'eau.   Afin de diminuer le taux de nitrate élévé,  le  Biodôme  de  Montréal  a  acquis  un  système  de  dénitrification  en  1998  qui consiste principalement en un reacteur à lit fluidisé alimenté au méthanol.  Or, depuis son installation, le système de dénitrification  fonctionnait avec une efficacité bien en dessous des  prévisions.   Il a alors été suggéré  que  la microflore  ne soit  pas bien adaptée  aux conditions du milieu.La problématique de la dénitrification de l'eau de mer du Biodôme se situe au niveau de la salinité et de la température interne du dénitrificateur qui est de l5-20°C.   De plus, le méthanol, utilisable par une faible variété de microorganismes,  est utilisé comme source de carbone pour les microorganismes de ce système de dénitrification.   L'ajout de métaux traces, tant dans des essais en laboratoire que dans le système de dénitrification,  nous a permis d'augmenter  le taux de dénitrification de l'ordre de 250%.  Cette hausse d'activité des bactéries dénitrifiantes était principalement attribuable au fer. Ce projet visait la caractérisation  microbiologique du dénitrificateur  marin du Biodôme de Montréal en vue d'une  amélioration de l'efficacité  du système de dénitrification.   La caractérisation des microorganismes impliqués a été effectuée par une approche de microbiologie classique et par une approche de biologie moléculaire (génothèque et électrophorèses sur gel de polyacrylamide  en gradient dénaturant (DGGE)).   De plus, le rôle et les interactions entre les différentes espèces microbiennes présentes dans le biofilm dénitrifiant ont été étudiés par la technique de l'hybridation  in situ fluorescente (FISH) et de la microautoradiographie (MAR).La microflore extraite des supports du réacteur a été cultivée sur trois milieux de culture différents.    Trois  types  de  bactéries  ont  été  isolés  en  culture  pure.    Ces  dernières appartiennent aux genres Hyphomicrobium, Paracoccus et à un nouveau genre bactérien de  la  famille  des  Phyllobacteriaceae.   Suite  à  une  analyse  complète  de  ce  nouvel organisme,  nous avons pu publier sa description  et le nommer  Nitratireductor aquibiodomus. Les bactéries non-cultivées ont été étudiées en constituant une génothèque des gènes de l'ARN  l6S  ribosomal (ADNr  16S).   Le même profil de digestion, à l'aide d'enzymes  de restriction, a été retrouvé chez plus de 70% des clones.   Les séquences de quelques représentants du groupe le plus abondant ont révélé une affiliation avec le genre Methy/ophaga  (gamma-protéobactéries).  Le séquençage des clones des autres profils de restriction  a  révélé  des  affiliations  avec  des  bactéries  dénitrifiantes  et  des  bactéries marines.   Suite au remplacement des supports de fluidisation dans le dénitrificateur,  la colonisation de ceux-ci a été suivie par PCR-DGGE.  Les profils de migration sur DGGE ont  évolué   pendant  les  cinq  premières  semaines   puis  sont  demeurés   pratiquement inchangés par la suite.L'étude de la structure du biofilm colonisant dans le dénitrificateur  marin du Biodôme de Montréal  a été réalisée.   L'utilisation  de l'hybridation  in situ fluorescente  a permis de localiser  les  microorganismes  de  genre  Methylophaga, de  genre  Hyphomicrobium,  de gamma-protéobactéries, d'a/pha-protéobactéries  et  de  protozoaires. 	Les  résultats  ont montré  que  les  protozoaires  recouvraient  presque  entièrement  la  surface  du  biofilm sourtout   lorsque   le  biofilm   était   jeune   et   mince. 	De   plus,   des   micro-colonies d'Hyphomicrobium ont été observées dans le biofilm seulement après trois semaines de colonisation.   Les gamma-protéobactéries constituaient  la population  la plus importante du complexe  microbien  du dénitrificateur. 	Cela  corrobore  les résultats  antérieurs  qui montraient  les Methylophaga  comme  le groupe  de  bactéries  dominantes.  L'utilisation d'une  sonde  spécifique  aux Methylophaga  a indiqué également  que ceux-ci  étaient  les plus abondants  dans  le dénitrificateur  du  Biodôme  de Montréal. 	Ces essais  ont  aussi montré que les archaebactéries  sont absentes du dénitrificateur.  À sa maturité, le biofilm contenait environ 57% de Methylophaga, 7% d'Hyphomicrobium et 5% d'eucaryotes.

Des  essais  de  microautoradiographie   couplée  à  l'hybridation   in  situ  fluorescente  ont montré que c'était  principalement  les a/pha-protéobactéries qui assimilaient  le méthanol dans des conditions de dénitrification.  Les Methylophaga  n'ont pas assimilé de méthanol en  condition  dénitrifiante   malgré  la  forte  proportion  qu'elles occupaient  au  sein  du biofilm du dénitrificateur.L'étude  effectuée a permis de mieux connaître la dénitrification  en eau de mer ainsi que les bactéries retrouvées dans un tel écosystème.  Elle a aussi contribué à l'amélioration du taux de dénitrification  du  procédé  de dénitrification  installé  au  Biodôme  de  Montréal. Cette étude, complémentairement  à une modification du design du dénitrificateur,  devrait permettre un maintien de la concentration  de nitrate dans le Saint-Laurent  Marin sous la barre des 50 mg N-N03/L.


identifier: L'Abbée, José-Bruno  (2006). Métabolisme di 1,1,1-trichloro-2,2-bis(4-chlorophenyl)éthane (DDT), du dibenzofuranne et du dibenzo-p-dioxine par certaines dioxygénases du biphényle  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 101 p.

subject: ddt dibenzofuranne dibenzo-p-dioxine dioxygenase biphenyle

abstract:
De multiples  substances toxiques, tant pour  la faune que pour  la flore sont présentes dans l'environnement.  Parmi celles-ci compte plusieurs  analogues  du biphényle,  dont  les biphényles polychlorés  (BPC), les dérivés  chlorés  du dibenzofuranne (DF), la  dibenzo-p-dioxine (DD) ainsi  que  le 1,1,1-trichloro-2,2- bis(4-chlorophényl)éthane (DDT) qui sont des polluants  persistants dans l'environnement. Leur persistance  est attribuée  à l'absence  de voies cataboliques microbiennes   efficaces  pour   leur   dégradation.  Cependant  certaines   bactéries isolées   de   l'environnement   tels   Comamonas testosteroni B-356,  Burkholderia xenovorans  LB400 et  Cupriavidus necator  A5 possèdent   une  voie  catabolique  du biphényle capable de dégrader partiellement,  par co-métabolisme,  certains  de ces polluants   persistants.    La  voie   catabolique    du   biphényle   est   initiée   par   la dioxygénase  du biphényle (BPDO) qui introduit deux atomes d'oxygène sur deux carbones  adjacents  du  noyau  biphényle.     Cette  enzyme  comporte trois composantes, dont l'oxygénase interagissant directement avec le substrat  pour catalyser l'oxygénation, la ferrédoxine et la réductase de la ferrédoxine étant deux composantes qui catalysent le transport d'électrons du NADH à l'oxygénase. Chez les souches B-356 et LB400, les gènes bphA et bphE codent pour les deux sous-unités qui formant  l'oxygénase. Les gènes bphF et bphG codent  respectivement pour  la ferrédoxine  et la réductase  de la ferrédoxine.  Le développement de BPDO douées de capacités  cataboliques  accrues  envers  les analogues persistants du  biphényle permettra,  éventuellement de construire des bactéries  recombinantes portant  des voies cataboliques plus efficaces pour  la dégradation de ces polluants. Plusieurs travaux  récents  ont  permis  d'obtenir, par  ingénierie  génétique,  des  BPDO plus performantes capables de dégrader un éventail  plus grand  de congénères de BPC que les BPDO isolées de souches  sauvages.  C'est  le cas en particulier  des BPDO variantes 11-9, Ill-17, 111-34, 111-37 et 111-52 qui ont été obtenues par recombinaison  in vitro aléatoire  (« DNA-Shuffling ») entre  les  gènes  bphA des  souches   B-356 et LB400.

Les objectifs de ce travail étaient 1-) de vérifier le potentiel catabolique  des BPDO parentales  de  LB400 et  B-356 envers  le OF et le DO 2-) de comparer  les propriétés catalytiques  des BPDO variantes 11-9, 111-17, 111-34, 111-37 et 111-52 envers le DDT et des BPDO parentales  de LB400 et B-356. Dans le cas du DF, nous avons observé qu'une souche  recombinante d'Escherichia coli produisant la dioxygénase de  LB400 pouvait   dégrader   le  OF  à  un  taux  plus  élevé  (30 nmol  en  18  H) comparativement à une souche exprimant  la dioxygénase  de B-356 (2 nmol en 18
H).  Cependant, les deux dioxygénases  ont produit  le même dihydro-dihydroxy dibenzofuranne comme métabolite  majeur, et de faibles quantités de 2,2',3- trihydroxybiphényle. Lorsque le DO était utilisé comme substrat, le 2,2',3- trihydroxybiphényle éther était  le seul métabolite détecté  et il était  produit à  un taux  similaire  pour  les deux  enzymes,  indiquant une  attaque  similaire  pour  ce composé. Ces résultats  montrent  que la régiospécificité de ces deux  dioxygénases envers  le  DF et  le  DO  est  semblable,  même  si  pour   plusieurs   analogues   du biphényle,   les   BPDO  de   B-356  et   LB400 ont   fréquemment  un   patron   de métabolisme  très différent. Ces résultats suggèrent  que la coplanarité du OF et du DO influence la régiospécificité de la dioxygénase d'une manière  plus importante que leurs congénères de BPC ayant des substituants en position ortho. L'utilisation de OF marqué  au deutérium a permis de valider la production de 2,2',3- trihydroxybiphényle par oxygénation angulaire du OF.

Dans le cas du  DDT, nous avons démontré que la BPDO de B-356 est aussi efficace que la BPDO de Cupriavidus  necator AS, une dioxygénase  connue  pour sa capacité à oxygéner le DDT efficacement. Cependant, contrairement à la BPDO de AS qui  ne  produit   qu'un  seul  métabolite,  celle de  B-356 produit   un  deuxième métabolite dihydrodiol en petite quantité.  D'autre  part, la BPDO de LB400 catalyse la dioxygénation  du DDT très inefficacement.  Nous avons comparé les propriétés catalytiques  des variants 11-9, 111-17, 111-34, 111-37 et 111-52 envers le DDT étant  des hybrides résultants de recombinaisons génétiques entre bphA de LB400 et de B-356. Les résultats  démontrent que la régiospécificité ainsi que l'efficacité à catalyser  la réaction varient grandement selon le variant  utilisé. Le variant 111-37 était le moins efficace.	L'efficacité  des  variants  111-52, 111-17 et 11-9  à  oxygéner  le  DDT était semblable  pour  ces  enzymes,  et  ces  variants   produisaient principalement un métabolite qui était identique au métabolite mineur produit  par la BPDO de B-356. Enfin, l'efficacité du variant 11-34 était moindre  que celle des trois autres variants, mais  cet enzyme  produisait  exclusivement   un  métabolite  qui  correspondait  au métabolite  majeur  produit   par  la  BPDO de  B-356. Des  analyses  RMN  de  ces métabolites purifiés ont permis d'identifier les deux métabolites comme étant deux diastéréoisomères	de 	1,1,1-trichloro-2,(4-chlorophény1-2,3-dihydroxy-4,6- cyclohexadiène)-2-(4'-chlorophényl)éthane   (DDT-2,3-dihydrodiol).   Ces  résultats montrent que certaines modifications structurales de la BPDO permettent  d'altérer, non seulement  la régiospécificité, mais la stéréospécificité  de l'enzyme  envers  les analogues  du  substrat. Nous  avons  comparé  les séquences  primaires  en  acides aminés des BphA des variants avec celles des BphA parentales. Cette comparaison a permis de montrer  qu'un segment de 7 acides aminés de l'enzyme, appelé région Ill,   influence   significativement    la 	capacité   de   la 	dioxygénase   à 	catalyser l'oxygénation du DDT efficacement. Cependant, la stéréospécificité envers le DDT est déterminée  par un (ou quelques) acides aminés compris entre les résidus 237 et
261 de BphA de LB400 qui sont communs pour le variant 111-34 et les parents B-356 et AS qui produisent principalement  le même métabolite du DDT.


identifier: Lacasse, Martine  (2007). Caractérisation toxicologique et chimique des produits de combustion d'un composé pur du tabac : l'acide chlorogénique  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en sciences expérimentales de la santé, 93 p.

subject: Tabac cancer tabagisme toxicite catechol ac

abstract: Le tabac est un sujet entouré de controverse en raison de certains effets adverses ayant été attribué à sa consommation. En effet, des études épidémiologiques  ont mis en évidence une association entre certaines maladies ou cancers et le tabagisme. Toutefois, Je mécanisme précis à l'origine de l'apparition de ces maladies n'a pas encore été établi. La plante de tabac est constituée de milliers de composés dont près de 5000 répertoriés dans sa fumée. L'étude de la fumée du tabac est un donc objet d'étude d'une complexité incroyable. Jusqu'à présent, la majorité des études ont porté sur la chimie du tabac. Dans ce contexte, notre approche  consiste à combiner la toxicologie et la chimie pour réaliser une  étude  originale  sur  la  fumée.  Une  étude  antérieure  ayant  révélé  que,  parmi   12 principaux composés du tabac, l'acide chlorogénique (AC) est un des composés induisant une forte toxicité, ce composé sera notre objet d'étude. La phase particulaire de la fumée de l'AC est donc caractérisée toxicologiquement et chimiquement. Pour ce faire, la fumée de l'AC  a été captée  sur des  filtres Cambridge  et, afin d'en extraire  sélectivement  les composés,  cinq  solvants  ont  été  utilisés.  Ce sont  Je  diméthylsulfoxyde  (DMSO),  J'eau distillée (H20), Je méthanol (MeOH), le dichlorométhane (DCM) et J'acétate d'éthyle (EA). Les cinq extraits ainsi générés ont été caractérisés selon des tests toxicologiques in vitro incluant  Je  test in vitro du micronoyau  (IVMNT) et le test du cycle cellulaire  ainsi que chimiquement   par  chromatographie   gazeuse  couplée  à  un  spectromètre  de  masse (GC/MS) et par chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse (HPLC/MS). Selon le IVMNT, l'extrait  DCM  serait le plus toxique et selon Je  test du cycle cellulaire, J'extrait DCM induirait la plus forte inhibition du cycle cellulaire. La chromatographie liquide préparative  (LC)  a  été  utilisée  pour  fractionné  l'extrait  DMSO  générant  trois  fractions principales. La fraction contenant Je catéchol a induit la plus forte toxicité dans le IVMNT et contenait principalement  du catéchol et ses dérivés. La plus forte toxicité de la fraction renfermant Je catéchol et ses dérivés ainsi que les données dans la littérature rapportant la toxicité du catéchol suggèrent  le catéchol comme principal composé responsable  de la toxicité induite, suite à la combustion de l'AC.


identifier: Lacasse, Patrick  (2008). Évaluation du potentiel vaccinal de pseudoparticules du virus de la mosaïque du papayer exprimant un épitope T cytotoxique immunodominant du virus de la choriomeningite lymphocytaire  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 137 p.

subject: vaccin pseudoparticule virus cellule dentritique mosaïque papayer choriomeningite lymphocytaire

abstract:
La plupart  des vaccins  utilisés de nos jours  permettent  le développement de réponses immunitaires protectrices  contre  certains  pathogènes  en  induisant  des anticorps  (Ac) spécifiques et neutralisants chez les patients  immunisés. Malgré l'efficacité indéniable de ces  vaccins  dans certains  cas, ils sont  souvent  inefficaces  dans  la lutte contre  les infections  virales  chroniques qui  requièrent   habituellement, pour  être  résorbées,   le développement de réponses  cellulaires  spécifiques et la production  de lymphocytes T CD8+  cytotoxiques  (CTL).  Grâce   aux   récentes   découvertes   et  avancées   dans   le domaine de la vaccinologie, de nouvelles stratégies  vaccinales ont été mises de l'avant afin  de  remédier   à ce  problème.   Plusieurs   études   ont  démontré   l'efficacité  des pseudoparticules virales (PPV) dans l'induction de réponses  immunitaires à médiation cellulaire.  Cependant, la co-administration d'adjuvant est souvent  nécessaire  afin  de permettre   l'induction  de  réponses   cytotoxiques  protectrices   et  de  longue   durée. Récemment, nous avons  démontré  que  la surexpression  de la protéine  de la capside (CP)  du  virus de  la mosaïque  du  papayer  (PapMV)  dans  Escherichia coli (E. coli) mène à la production  de PPV  via l'auto-assemblage des protéines  en des  particules quasi   identiques   au  virus  sauvage.   De  plus,  nous  avons  démontré   la  possibilité d'exposer des épitopes  de virus murins ou humains à la surface de ces PPV sans nuire à  leur capacité  d'assemblage. Dans  la présente  étude,  nous évaluons  la capacité  des PPV du PapMV  exposant  l'épitope T CD8+ immunodominant p33 (PPV du PapMV p33) du virus de la chorioméningite lymphocytaire (LCMV)  à induire, chez la souris, une   réponse   cellulaire   protectrice    en   absence   d'adjuvant.  Tout   d'abord,   nous démontrons,  autant   in  vitro qu'in  vivo,  que  les  diverses   PPV   du  PapMV   sont efficacement  captées   par   les   cellules   dendritiques   (DC)   de   la   rate  des   souris immunisées. De plus,  notre étude  met en évidence  la capacité  des diverses  PPV  du PapMV  à entraîner  la maturation  des DC in vivo. D'autre part, des tests in vitro et in
vivo ont  démontré   que  les  PPV  du  PapMV-p33  sont  efficacement  apprêtées   et

présentées  par les DC dans le contexte  du complexes  majeurs d'histocompatibilité de classe 1 (CMH-1), permettant  ainsi d'exposer l'épitope viral étranger  à des CTL  p33- spécifiques et d'entraîner leur activation  et leur prolifération.  De plus, l'immunisation de souris  C57BL/6  en absence d'adjuvant induit la production  d'un  grand  nombre de CTL p33-spécifiques. D'ailleurs, l'infection subséquente  des souris immunisées  par le
LCMV  induit  l'expansion de la population de CTL  p33-spécifiques et l'activation de leur  fonctions effectrices,  permettant ainsi  de  protèger les  souris contre   l'infection. Nous   démontrons également  que   le  niveau   de  protection  induit   par   les  PPV   du PapMV-p33  est   dépendant  de   la  dose   et   de   la  fréquence  d'administration.   En contusion, ces  résultats mettent  en évidence la grande efficacité des PPV du PapMV  à cibler les DC. De  plus,  grâce  à leur capacité à induire  la maturation des DC,  les PPV

du  PapMV   présentent une  activité intrinsèque d'adjuvant qui  optimise probablement leur  capacité à  induire des  réponses cellulaires efficaces. Ces  résultats démontrent l'efficacité des  PPV  du  PapMV  à être  utilisées comme plateforme vaccinale capable d'induire une réponse cellulaire spécifique contre  un épitope étranger présenté à leur surface.


identifier: Lafortune, Isabelle  (2007). Étude de la diversité d'un consortium bactérien capable de dégrader les hydrocarbures aromatiques polycycliques dans un système biphasique  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 128 p.

subject: hydrocarbure hap polluant degradation

abstract:
La transcription des symboles et des caractères spéciaux utilisés dans la version originale de ce résumé n’a pas été possible en raison de limitations techniques. La version correcte de ce résumé peut être lue en PDF.
Plusieurs sols sont contaminés par des hydrocarbures provenant d'activités industrielles. Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des polluants issus de la combustion de matière carbonée et sont retrouvés comme sous-produits de raffineries. Certains de ces HAP, principalement les HAP de haut poids moléculaire (HAP HPM), ont un potentiel mutagène et cancérigène. Par contre, ces HAP sont très peu disponibles pour les microorganismes capables de les dégrader, car ils sont très hydrophobes et  s'attachent  aux  particules du  sol.  Une  méthode  intéressante pour augmenter la biodisponibilité des HAP HPM est 1'utilisation  de systèmes biphasiques. Dans ces systèmes, il y a une phase hydrophobe dans laquelle sont dissous les HAP et ces HAP peuvent diffuser progressivement vers la phase aqueuse où les bactéries peuvent les dégrader.

Les buts de ce projet de recherche ont été d'étudier  un consortium bactérien dégradant les HAP dans un système biphasique afin de déterminer et caractériser les espèces bactériennes présentes, de déterminer l'effet de l'ajout de HAP de faible poids moléculaire sur  la dégradation des  HAP HPM et sur  la diversité du consortium, et finalement de vérifier la présence de certains gènes de dégradation de composés aromatiques.

Pour identifier les bactéries présentes dans ce consortium, une génothèque d'ADNr  168 a été générée et  les inserts de différents clones ont été séquencés. Les résultats ont révélé que la majorité des clones sont affiliés aux classes des alpha- et des beta-protéobactéries. D'ailleurs,  plusieurs des genres bactériens identifiés dans le consortium, par exemple Achromobacter  sp., Sphingomonds  sp., Sphingobium  sp. et Paracoccus sp., ont déjà été liés à la dégradation des HAP. De plus, la diversité du consortium a été étudiée par culture sur gélose. Par cette méthode, Il souches ont été identifiées suite au séquençage de l'ADNr 168. Les expériences ont d'ailleurs montré que la souche 89, affiliée au genre Novosphingobium, peut dégrader le pyrène et le chrysène
dans un système biphasique.

L'ajout de HAP de faible poids moléculaire a eu, en général, un effet stimulateur sur la dégradation des HAP HPM, principalement sur le benzo[a]pyrène. Il a pu aussi être déterminé,  par  PCR-DGGE,  que  certaines  espèces  bactériennes,  affiliées  aux Bacteroidetes, aux Sphingomonas sp. et aux Achromobacter sp., ont été particulièrement privilégiées suite à cet ajout.

Dans le consortium, la présence de certains gènes de dégradation de composés aromatiques a aussi été évaluée par PCR à l'aide d'amorces  dégénérées. Les essais ont montré la présence de trois types de dioxygénases, soit une catéchol 2,3-dioxygénase (gène xy!E), une 2,3-dihydroxybiphényle 1,2-dioxygénase (gène bphC) et une autre dioxygénase (gène nidA) principalement retrouvée chez les mycobactéries.


identifier: Lai, Sandra  (2007). La résistance aux agents antimicrobiens des bactéries engagées dans la motilité de type swarming  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 103 p.

subject:
pseudomonas
burkholderia
escherichia coli
serratia
marcescens
bacillus
subtilis
biofilm
quorum
sensing
antibiotique
metal

abstract: La motilité de type swarming est caractérisée par la migration rapide et coordonnée d'une population bactérienne sur une surface. D s'agit d'un comportement social marqué par une différenciation en cellules hyperallongées et  multiflagellées, et par la production de biosurfactant. Le swarming partage des similitudes avec le biofilm, notamment son caractère multicellulaire et une implication des systèmes de quorum sensing. L'une des caractéristiques importantes d'un biofilm est sa résistance élevée envers de nombreux agents antimicrobiens. Mes travaux ont consisté à  vérifier si  cette  propriété se  retrouvait également chez  les bactéries en swarming. Cinq espèces ont été choisies:  Pseudomonas aeruginosa,  Bacillus subtilis, Burkholderia thailandensis, Escherichia coli et Serratia marcescens. Les profils de résistance des cellules végétatives et des cellules en swarming ont été déterminés à l'aide d'antibiogrammes couvrant divers antibiotiques de familles différentes. D a été trouvé que les bactéries en swarming présentaient une résistance accrue envers tous les antibiotiques testés, sauf  les  peptides antimicrobiens. Ceci  indique  que  la  résistance aux  antibiotiques est effectivement une caractéristique générale du  swarming.  Afin de  mieux caractériser le phénotype résistant des bactéries en swarming,  P. aeruginosa  PA14 a été choisie comme bactérie modèle. Des tests de résistance envers d'autres agents antimicrobiens comme les métaux lourds ont montré une plus grande résistance des bactéries en  swarming  envers l'arsenite. La résistance envers le triclosan a été observée chez les bactéries en swarming de B. subtilis et E. coli. Le triclosan n'a  pas pu être testé avec P. aeruginosa  étant donné sa résistance naturelle à ce biocide. Des mutants dans des pompes à efflux (gènes mexA, mexC et mexE inactivés) et un mutant dans un mécanisme de résistance associé au biofilm (gène ndvB muté) présentent la même résistance que la souche sauvage PA14, suggérant que ces mécanismes ne sont pas impliqués. Dans le but d'identifier des gènes de P. aeruginosa PA14 impliqués dans cette résistance associée au swarming, une banque d'environ 10 000 mutants a été générée par insertion transpositionelle aléatoire. Suite au criblage d'environ 4 000 de ces mutants (couverture théorique de 40-45% du génome), aucun gène n'a pu être mis à jour. Finalement,	des	tests	de	perméabilité	utilisant	une	sonde   fluorescente,	le 	1-N phénylnaphtylamine (NPN), ont révélé que la membrane externe des bactéries en swarming de P. aeruginosa PA14 incorporait moins de NPN que celle des bactéries végétatives. Ceci suggère qu'une  réduction de la perméabilité membranaire serait un mécanisme de résistance associé  au  swarmbzg, du  moins  chez  les  bactéries  à  Gram-négatif.  Étant  plus  facile  à investiguer que les biofilms, le swarming peut par conséquent  représenter  un bon modèle d'étude de la résistance aux agents antimicrobiens des comportements multicellulaires bactériens.


identifier: Lamarche, Philippe  (2009). Rôle du récepteur de la protéine G 128 dans l'alloréactivité du TCR 2.102 contre I-EP  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 127 p.

subject: complexe majeur histocompatibilite cellule t lymphocyte

abstract:
La transcription des symboles et des caractères spéciaux utilisés dans la version originale de ce résumé n’a pas été possible en raison de limitations techniques. La version correcte de ce résumé peut être lue en PDF.
L'arrivée sur le marché de plusieurs classes d'immunosuppresseurs a permis de considérer la transplantation comme une thérapie efficace. Cependant, les mécanismes entourant l'alloréactivité sont encore mal définis. Bien qu'il soit établi que l'alloréactivité soit induite par la reconnaissance des complexes CMH/peptides allogéniques par les lymphocytes T, la contribution des peptides du soi impliqués dans cette interaction reste grandement indéterminée. Notre laboratoire utilise un modèle d'étude du rejet de greffe basé sur le clone de cellule T 2.102, alloréactif contre l-EP. L'importance de  la contribution du  peptide du soi  impliqué dans cette réaction d'alloréactivité a déjà été démontrée par l'élaboration d'un peptide synthétique (EPM) permettant, lorsque présenté dans le cadre de l-EP, une forte stimulation du clone T 2.102. Bien que le peptide naturel du soi impliqué dans l'alloréactivité face à l-EP ne soit pas encore connu, le récepteur couplé à la protéine G 128 (GPR128) a pu être identifié comme un candidat potentiel. Une précédente étude a déjà démontré le potentiel d'activation  de  cet  allopeptide GPR128(531-545) sur  le  TCR  2.102. Toutefois, sa nature d'allopeptide naturel reste à démontrer. L'objectif de ces travaux vise donc à déterminer si GPR128 se retrouve naturellement apprêté et présenté dans un contexte l-EP.
Nous avons donc tenté de transfecter une lignée de fibroblastes (CHO-EP) ainsi qu'un lymphome B (CH27-EP), tout deux exprimant le CMH II l-EP, à l'aide d'un vecteur permettant l'expression de GPR128. Toutefois, des problèmes techniques ont retardé le clonage de GPR128 et l'élaboration du vecteur d'expression. Nous avons donc procédé à  l'évaluation de  la  capacité d'apprêtement et  de chargement de l'épitope putatifGPR128(531-545) à l'aide de l'utilisation d'un vecteur d'expression en fusion avec la chaîne invariante permettant le ciblage des compartiments endosomaux et dont le fonctionnement fut déjà validé de façon antérieure à ces travaux. Ainsi, nous avons pu démontrer que l'épitope putatif GPR128(531-545) ne comportait pas de site de clivages spécifiques aux différentes cathepsines et peptidases retrouvées dans la voie d'apprêtement endosomale des fibroblastes (CHO-EP) et des lymphomes B (CH27-EP) et permet donc un apprêtement cons ctif. Nous avons aussi pu démontrer que la voie endosomale de ces deux lignées étaient apte à apprêter un segment plus important de GPR128 (GPR128(526-559)) de façon à générer une réponse alloréactive du clone T 2.102.
endosomale de ces deux  lignées étaient apte à apprêter un segment  plus important de GPR128  (GPR128(526-559))  de façon à générer  une réponse alloréactive  du clone T 2.102.

Durant ces travaux, nous avons dû élaborer un protocole de transfection transitoire du  lymphome  B,  à  l'aide  de  la  microporation  et  permettant  un  important  taux  de transfection combiné à une faible mortalité. Le protocole mis en place nous a permis d'atteindre une efficacité de transfection pariculièrement élevée pour un lymphome B.
De plus, lors de ces travaux, nous avons documenté l'expression  de GPR128 dans les CPA. Ainsi nous avons pu démontrer la faible expression de GPR128 dans des CPA retrouvées dans la rate, suggérant alors que l'allopeptide  GPR128(531-545) n'est apprêté et présenté que suite à la phagocytose de corps apoptotiques de cellules non immunitaires retrouvées dans la rate et exprimant un fort taux d'expression  de GPR128.
Afin  de  confirmer  le  rôle  de  GPR128(531-545)  dans  l'alloréactivité   du  TCR 2.102, des travaux restent encore à réaliser. En premier lieu, nous devons encore valider que l'expression  de GPR128 sous sa forme intégrale dans des fibroblastes (CHO-EP) et des lymphomes B (CH27-EP) est apte à induire une réaction alloréactive  face au TCR
2.102.  En  second  lieu,  l'utilisation   d'ARNi   in  vitro et  in  vivo  pourrait  confirmer l'implication de GPR128(531-545) dans le processus alloréactif du TCR 2.102.


identifier: Langlois, Chantal  (2005). Étude structure-activité de l'endothéline-1 : détermination d'éléments responsables de la liaison, de l'activation et de la sélectivité des récepteurs ETa et ETb  Thèse.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en biologie, 206 p.

subject: et endotheline peptide

abstract:
La transcription des symboles et des caractères spéciaux utilisés dans la version originale de ce résumé n’a pas été possible en raison de limitations techniques. La version correcte de ce résumé peut être lue en PDF.

L'endothéline   (ET)  fait  partie  d'une   famille  de  peptides  vasoactifs  constitués  d'une chaîne de 21 acides aminés. Cette chaîne est repliée par deux ponts disulfures et ses extrémités N-et  C-terminales sont libres. ll existe trois isoformes de l'ET soit ET-1, ET-2 et ET-3, qui diffèrent entre elles par leur structure ainsi que par leur activité biologique. En effet, ET-1 et ET-2 semblent posséder une activité vasoconstrictrice alors que ET-3 engendrerait plutôt une  vasodilatation. L'activité biologique des ETs s'exerce, chez les mammifères,  via  deux  types  de  récepteurs : ET A   et  ET8 •    Le  premier  se  retrouve principalement sur les cellules musculaires lisses des vaisseaux sanguins et il possède une affinité plus grande pour ET-1 et ET-2 que pour ET-3.   Sa stimulation entraîne une vasoconstriction   puissante  et  soutenue.  Le  récepteur  ET8   possède  une  plus  vaste distribution dans l'organisme et ne présente aucune spécificité envers l'une ou l'autre des isoformes de l'ET.

Cette étude visait à déterminer  les éléments de la molécule d'ET-1  importants  pour la liaison et 1'activation des récepteurs ETA  et ET8, mais aussi ceux responsables de la sélectivité  de  ceux-ci.  En  ce  sens  plusieurs  séries  d'analogues   de  l'ET-1,   en  plus d'analogues   tronqués   du   segment   C-terminal   ont  été   développés.   Ces   analogues peptidiques ont été synthétisés sur phase solide au moyen de la chimie Fmoc ou t-Boc. Après   clivage,   certains   analogues   ont   subi   des   réactions   de   cyclisation   et   de déformylation. Les analogues ont ensuite été purifiés par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) préparative sur phase inverse. Chaque analogue a finalement été caractérisé  par  CLHP  analytique  sur  phase  inverse  et  par  spectrométrie   de  masse (MALDI-TOF).

L'évaluation   pharmacologique   des  analogues  a  été  réalisée  sur  deux   préparations tissulaires  riches  en  l'un  ou  l'autre  des  deux  récepteurs  de l'ET.  Ainsi,  des anneaux d'aorte de rat dénudée de leur endothélium ont permis de déterminer l'activité  biologique des analogues sur le récepteur ETA  tandis que le parenchyme pulmonaire de cobaye a été utilisé pour évaluer leur activité sur le récepteur ETs. L'affinité  de certains analogues a été évaluée par des essais de compétition, contre l'ET-1  radiomarquée, sur des cellules CHO  exprimant  soit  le  récepteur  ETA  ou  le  récepteur  ET8.  De  plus,  des  études  de dichroïsme circulaire ont été effectuées afin d'évaluer l'arrangement  structural de certains analogues.

Les résultats obtenus sur les préparations ETA ont montré pour la première fois, contrairement au concept établi et présenté dans la littérature, que la structure complète de l'ET-1   n'est   pas  nécessaire  pour  l'activation   du  récepteur  ETA.  Le  segment  9-21 contiendrait   en  effet   tous   les  pharmacophores,   alors  que  le   segment   N-terminal participerait  plutôt  à  l'affinité  du  peptide  pour  le  récepteur.  De ces  pharmacophores, l'acide  glutamique  de  la  position  10  semble  jouer  un  rôle  de  premier  plan  dans  le processus de liaison et d'activation  alors que la lysine-9 et l'acide  aspartique-lB auraient plutôt un rôle dans la stabilisation de la structure secondaire. À l'intérieur  du fragment 9-
21, la présence de modifications aux extrémités N- ou C-terminales semble aussi agir en
stabilisant cette dernière. En nous basant sur les résultats de structure-activité et sur ceux obtenus par dichroïsme circulaire, nous proposons que le segment C-terminal de l'ET-1 adopte  une structure  en  hélice  irrégulière  jusqu'à  son  extrémité  comme  proposé  par l'équipe   de  Wallace  suite  à  des  études  par  cristallographie.  Cette  structure  permet d'aligner  le groupement  carboxylique  terminal avec l'imidazole  de l'His16  et le noyau phénolique   de   la   Tyr 13    de   façon   à   former   un   relais   de   charge   permettant vraisemblablement d'activer  le récepteur ETA  par un mécanisme moléculaire similaire à celui retrouvé au site catalytique des sérine protéases (Langlois et al., 2003).

Les  résultats  obtenus  sur  les  préparations  de  parenchyme  pulmonaire  de cobaye,  ont montré que la présence de la charge positive, portée par la chaîne latérale de la lysine, à l'extrémité  N-terminale des analogues 9-21 défavoriserait la liaison et 1'activation du récepteur  ET8.      La  position  13  semble  également  jouer  un  rôle  important  dans  la sélectivité du fragment envers le récepteur ETA• En effet, le remplacement de la Tyr par un acide aminé non ionisable a augmenté l'activité  biologique des analogues du fragment
9-21 sur les préparations pulmonaires. Finalement, nos résultats sont en accord avec notre
hypothèse à savoir que le récepteur ET8  accommoderait un ligand de structure allongée, hautement hydrophobe dont l'extrémité C-terminale serait repliée de façon à placer le tryptophane-21 dans l'environnement  voisin de la leucine-17.

Pour finir, nous avons vérifié si les fragments PTHrP (1-16) et PTHrP (1-23), définis récemment comme des stimulateurs des ostéoblastes lors du développement de métastases osseuses suite au cancer de la prostate, agissent comme agonistes du récepteur ETA•  Cette hypothèse avait été avancée par une équipe américaine en comparant les séquences de ces fragments à celle de l'ET-1.  Donc, nous avons repris ces fragments du PTHrP pour les étudier dans nos modèles pharmacologiques des récepteurs de l'ET.  Selon nos résultats, aucun des deux fragments n'a montré d'activité  contractile sur les préparations d'aorte de rat et de parenchyme pulmonaire de cobaye. De plus, même à des concentrations élevées, ceux-ci n'ont pu bloquer l'activité  biologique engendrée par l'ET-1  sur ces préparations. Finalement, les essais de liaison ont également montré qu'ils ne compétitionnent pas pour le même site de liaison que l'ET-1.  Par conséquent, il ne semble pas que l'activation  des ostéoblastes, observée lors du développement de métastases osseuses passe directement
par la voie traditionnelle de 1'ET-1 (Langlois et al., 2005).


identifier: Laurin, Véronique  (2005). Caractérisation microbiologique et optimisation de la dénitrification en milieu marin au Biodôme de Montréal  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en microbiologie appliquée, 127 p.

subject: denitrification milieu marin biodome

abstract:
Le  Biodôme  de  Montréal  possède  un  procédé  de  dénitrification  raccordé  au principal système de filtration de son mésocosme de 3 millions de litres d'eau de mer, le Saint-Laurent marin. Depuis la mise en fonction du procédé, la concentration en nitrates dans le mésocosme a grandement diminué. Elle demeure cependant au-dessus du seuil recommandé en aquarium  pour  assurer la  conservation de  la faune  aquatique. Depuis l'année  2000,  une équipe  multidisciplinaire composée de chercheurs et d'étudiants  de l'école Polytechnique de Montréal et de l'INRS-Institut Armand-Frappier travaille à l'optimisation du procédé de dénitrification. Mon projet de maîtrise s'est  inscrit dans le cadre de ces travaux et les différents objectifs ont traité de l'aspect  microbiologique du procédé de dénitrification.

Au cours de ce projet, les objectifs de recherche se sont divisés en deux volets:
1'optimisation et la caractérisation du procédé de dénitrification. Dans le volet optimisation, le rapport carbone/azote (C/N) optimal pour la dénitrification au méthanol a été déterminé par des essais en fioles. L'impact des divers rapports C/N sur la diversité de la flore microbienne a aussi été déterminé. Le rapport C/N optimal retenu selon les essais a été de
1,5. De plus, il a été démontré que la variation du rapport C/N n'influencait pas la diversité microbienne.

Toujours dans le volet optimisation, le second objectif visait à déterminer une méthode de conservation adéquate de la biomasse du dénitrificateur advenant un arrêt de ce dernier. Les essais  effectués  à  petite échelle  ont  démontré  que  la  conservation de la biomasse à -80°C avec 15% de glycérol était idéale car celle-ci présentait un excellent rendement de dénitrification même après une période de  17 mois de conservation. Cependant, la méthode de conservation retenue a été la congélation à -20°C avec 15% de glycérol puisque la biomasse a présenté un rendement équivalent à celui de la biomasse
conservée à -80°C avec 15% de glycérol. De plus, les installations au Biodôme permettant
la congélation à -20°C sont plus adéquates pour la conservation  d'une  grande quantité de supports du dénitrificateur.

Dans le volet caractérisation du procédé de dénitrification, trois objectifs ont été atteints. D'abord,  la croissance et l'évolution  de la flore microbienne  ont été étudiées tout au long des essais réalisés sur des unités pilotes reproduisant le procédé de dénitrification à plus  petite  échelle.   Les  résultats  ont  montré  que  la  source  de  carbone,  la  présence d'oxygène  et le mode d'opération influençaient la croissance et la diversité microbienne.

Les deux derniers objectifs du volet caractérisation visaient l'étude  des protozoaires du  dénitrificateur.   Dans   un  premier   temps  les  populations   de  protozoaires   ont  été identifiées par microscopie. Puis, une génothèque d'ADNr  18S a permis une identification plus  approfondie.   Les   résultats   ont   révélé  que  la  communauté   de   protozoaires   du dénitrificateur   était  dominée  par  les  ciliés.  D'autre   part,  des  essais  sur  l'impact   des protozoaires sur l'activité de dénitrification ont montré que ces derniers influençaient l'accumulation  d'intermédiaires, soit les nitrites, lors de la dénitrification.  Les essais ont aussi  montré  que  la  présence  des  protozoaires  réduisait  la  quantité   de  bactéries  en suspension dans le milieu.


identifier: Lavastre, Valérie  (2009). Viscum Album agglutinine-1 et réponse inflammatoire : modulation de l'apoptose chez les granulocytes  Thèse.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Doctorat en virologie et immunologie, 128 p.

subject:
inflammation
neutrophile
caspase lectine
cytosquelette
proteine

abstract:
Les  neutrophiles  exercent  un  rôle  primordial  lors  de  l'inflammation.   Chez   un organisme    sain,   l'inflammation    se   résorbe   d'elle-même,    principalement   via l 'élimi nation  des  neutrophiles  apoptotiques.  Un  dérèglement  dans  le contrôle  de l'apoptose peut entraîner plusieurs maladies graves. Il est donc important de découvrir de nouvelles molécules qui peuvent provoquer l'apoptose de ces cellules.

La Viscum album agglutinine-1 (VAA-1) est une lectine de plante qui appartient au groupe des protéines inactivant le ribosome, tout comme la ricine. La VAA-1 possède des propriétés anti-tumorales et peut également provoquer l'apoptose chez différents types cellulaires lorsqu'elle est utilisée à forte concentration (1 000 ng/mL). Ainsi, elle entraîne  la dégradation de plusieurs protéines du cytosquelette par l'entremise  d'un mécanisme dépendant des caspases.

Cette thèse présente principalement les résultats issus de quatre articles scientifiques présentant la VAA-1 comme une molécule anti-inflammatoire. En effet, nous avons investigué  les propriétés anti-inflammatoires  de  la VAA-1 dans  le modèle inflammatoire de la poche d'air murine. Nous avons remarqué que la VAA-l n'induit pas à elle seule le recrutement de cellules. Par contre, en combinaison avec un extrait bactérien, elle est capable de freiner le recrutement cellulaire et ce possiblement en rendant les cellules recrutées apoptotiques.

De   plus,   la  VAA-1  est  capable  d'induire   l'apoptose   chez   un  autre  type   de granulocytes, soit les éosinophiles, et une lignée cellulaire apparentée, les AML (acute myelogenous leulœmia) 14.3Dl0. Toutefois, l'apoptose  induite dans ces dernières cellules semble influencer différemment la destruction des protéines du cytosquelette et/ou  l'activation  des caspases, profil jusqu'à  ce jour respecté avec les autres types


identifier: Leblanc, Josée  (2005). Caractérisation moléculaire des protéines p34 et p39 de la nucléocapside enveloppée du granulovirus de Choristoneura fumiferana  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 131 p.

subject: insecticide tordeuse granulovirus

abstract:
Le but de ce travail de recherche consistait à caractériser deux gènes codant pour les protéines structurales p34 et p39 de la nucléocapside enveloppée du granulovirus de Choristoneura fumiferana (ChfuGV).  Les objectifs  étaient  de  cloner  et séquencer  ces gènes. Dans un premier temps, le séquençage de la protéine de 34 kDa, soit la p34, du ChfuGV par le biais des digestions tryptiques internes et de l'analyse  par HPLC, a permis d'obtenir  une courte séquence peptidique (IFQGV) présentant un pourcentage d'identité de 100% avec une portion de la séquence aminée de la protéine p39 de la nucléocapside enveloppée du granulovirus de Xestia c-nigrum. Par la suite,  un  fragment d'ADN correspondant au gène codant pour une portion de la p34 a été amplifié à l'aide d'amorces oligonucléotidiques dégénérées, cloné et séquencé. Le contenu en nucléotides G/C de la séquence nucléotidique obtenue (317 nucléotides) a été évalué à 48%. Un cadre de lecture ouvert de 106 acides aminés a été déduit de la séquence nucléotidique de l'amplicon.  Le contenu en acides aminés hydrophobes de la séquence aminée à été évalué à 57_51%  ct deux cystéines pouvant être impliquées dans la stabilité de la structure tertiaire cie cette protéine ont été observées.  Cependant, aucune homologie  concluante  n'a  été observée avec aucune autre séquences aminées répertoriées dans la littérature. Dans un deuxième temps,  l'amplification   à  l'aide  d'amorces  oligonucléotidiques   d'un   fragment  cl' ADN correspondant au gène codant pour une portion de la protéine de 39 kDa, soit la p39, du ChfuGV, a permis d'obtenir  une séquence  nucléotidique  de 570  nucléotides  ayant  un contenu en nucléotides G/C évalué à 40,5%. Un cadre de lecture ouvert  de 186 acides aminés  a  été  déduit  de  la  séquence   nucléotidique.   Le  contenu   en  acides  aminés hydrophobes de la séquence aminée à été évalué à 55,5%. Un pourcentage d'homologie de 88% a été observé avec une portion de la séquence aminée de la protéine d'enveloppe ODVP-6E du granulovirus de Cydia pomone/la. Le pourcentage  d'acides  aminés hydrophobes  contenus dans la séquence  aminée  de la p39 du ChfuGV  a été é valué à
50,5%.

Les connaissances obtenues lors de ce projet d'étude ont pemlis d'identifier et d'étudier  deux  gènes codant pour des  protéines structurales  d'un  entomopathogène,  le
ChfuGV, ayant un potentiel insecticide. Cette étude a amst penms d'améliorer  nos connaissances au niveau de la biologie moléculaire de ce virus, un domaine où jusqu'à ce jour très peu d'études ont été effectuées.


identifier: Leiva-Torres, Gabriel A.  (2008). L'importance des résidus hautement conservés de la protéine virale UL24 dans la pathogenèse du virus de l'herpès simplex 1  Mémoire.  Québec, Université du Québec, Institut National de la Recherche Scientifique, Maîtrise en virologie et immunologie, 78 p.

subject: vhs

abstract:
La  majorité  des  adultes  nord-américains  sont  infectés  par  le virus de 1 'herpès simplex  1 (VHS-1 ). Typiquement,  après  une infection  oro-labiale,  le virus  infecte  les neurones sensitifs et établit la latence dans les ganglions trigéminaux. Périodiquement, le virus se réactive, causant des infections  récurrentes.  Dans un modèle murin d'infection oculaire, les virus déficients en UL24 (UL24X) ont une réplication oculaire diminuée, une réplication neuronale fortement réduite et une réactivation pratiquement absente. Contrairement  au  virus  de  type  sauvage  (KOS),  UL24X  forme  des  plages  de  lyse syncytiale à des températures élevées et a une réplication réduite. UL24 est très conservé chez  les Herpesviridae.    Cinq  domaines  d'homologie  ont été  identifiés,  dans  lesquels plusieurs acides aminés sont hautement conservés dont certains formeraient un motif d'endonucléase de type PD (D/E)xK. Notre hypothèse est que ces résidus hautement conservés sont importants pour la pathogenèse du VHS-1 .

Afin de tester notre hypothèse, nous avons généré plusieurs versions mutantes du gène UL24 codant pour une ou deux substitutions d'acides  aminés hautement conservés. Des virus recombinants ont été produits en co-transfectant un vecteur contenant le gène UL24 muté et l'ADN  viral infectieux de vUL24 eGFPB contenant une cassette eGFP dans le cadre de lecture ouvert d'UL24. Les recombinants ont été criblés par la perte de fluorescence. Trois virus ont été produits : vUL24 E99AK 101 A, ciblant le site catalytique de la fonction putative d'endonucléase, vUL24 G 121 A, ciblant  un résidu situé dans un domaine d'homologie  adjacent à celui du motif d'endonucléase et vUL24 Q154A, visant un résidu hautement conservé du cinquième domaine. À 39°C, vUL24 Q154A a formé de petits syncytiums, vUL24 G 121 A a produit des syncytiums de taille moyenne et vUL24 E99AKIOIA  a produit de gros 	syncytiums  comparables  à ceux d'UL24X.  Aussi, la mutation des résidus E99 et K 101 a engendré une baisse de la réplication virale.

Afin  de  déterminer   l'effet   de  ces   mutations  sur   la  pathogenèse,   les  vtrus recombinants  ont été  testés dans  un  modèle  murin  d'infection  oculaire.  En  mutant  le résidu Q154A, peu d'effets  ont été observés sur la réplication aiguë oculaire, tandis que la réplication aiguë neuronale a été réduite. Lors des essais de réactivation d'explants de ganglions trigéminaux, le taux de réactivation des ganglions infectés par vUL24 Q154A était de 50%. vUL24 Gl21A  a eu une réplication aiguë oculaire et neuronale similaire au virus KOS et un taux de réactivation semblable a celui du virus de type sauvage. Chez vUL24 E99AKI01A,  la réplication aiguë oculaire a été inférieure à celle de KOS et la réplication  neuronale  a  été  diminuée  de  plus de  2  logs.  Aussi,  la  réactivation  a  été observée chez moins de 40 % des ganglions infectés. Cette étude a permis de déterminer que le site catalytique potentiel était crucial pour la pathogenèse du virus, tandis que le résidu Q154 a eu une importance moindre et que G121 était peu important pour la pathogenèse du VHS-1, malgré sa forte conservation et que la substitution de ce résidu cause la fom1ation de plages syncytiales. Aussi, nous corroborons l'hypothèse  qu'UL24 pourrait  être  une  protéine  multifonctionnelle,  puisque  la  mutation  du  motif d'endonucléase  n'a pas produit un phénotype similaire à celui d'UL24X.